1 . 很多极端环境（高温、干旱、盐碱等）中的微生物仍未获得分离和培养。我国研究人员提出了一些从沙漠环境中分离、纯化原核微生物的策略。回答下列问题：
(1)微生物的纯化培养包括______、灭菌、______、分离和培养等步骤。
(2)培养基一般都含有______、______、______和无机盐等。沙漠炎热，其中很可能存在嗜热微生物。若要筛选嗜热微生物需在高温下进行培养，此时琼脂不凝固，非固态的培养基上无法获得微生物的单菌落，因此需选用在高温下仍有______能力的物质代替琼脂。
(3)对所获得的沙漠环境中的样品进行溶解和稀释（如下图所示），每次稀释时需要在试管中加入______和1mL待稀释的菌液。研究人员在进行接种时，并不是只接种10^-4的稀释液，而是将下图中四个浓度均进行接种，原因是______。

(4)用筛选得到的耐高温菌种作为生物反应器获得耐高温的DNA聚合酶（Taq酶），生产过程不易染菌，原因是______。
(5)研究发现，将从沙漠中采集回来的样品置于各种培养基中培养，仍有很多微生物不能被分离筛选出来，推测其原因可能是______。（答出一点即可）

2 . 新冠病毒是一类具有包膜的RNA病毒，会感染人类并引起呼吸综合征。应对传染性强的病毒感染，需要免疫效果持久的疫苗。最新研发的疫苗是核酸疫苗（包括DNA疫苗和RNA疫苗）。下图1为DNA疫苗制作流程，图2和图3分别为备选质粒和从病毒获得的抗原基因结构示意图。回答下列问题。
   
(1)基因表达载体需要具备_______________才能在受体细胞中扩增。过程①中，如果利用PCR技术扩增抗原基因，在设计引物时需要在两种引物的一端分别加上____________________两种限制酶的识别序列，以便重组质粒的构建。
(2)抗原基因首端的启动子的作用是_________________ 。进行步骤③时需用______________溶液处理大肠杆菌。
(3)如果处理后的受体细胞同时具备标记基因①和标记基因②所决定的性状，试分析可能原因：_____________________________。
(4)从疫苗成分的角度分析，DNA疫苗比蛋白疫苗对冷链运输要求低的原因是 __________________。

3 . 镰刀型细胞贫血症是由于基因突变，导致造血干细胞分化形成的红细胞异常导致严重疾病。如下图表示利用现代生物技术治疗镰刀型细胞贫血症的设想流程图，其中iPS细胞为诱导形成的多能干细胞，与胚胎干细胞的功能类似。回答下列问题。

   

(1)据图分析，该治疗方法运用的现代生物技术有_____（答出2种即可）。该基因治疗属于_____（答“体内”或“体外”）基因治疗的范畴。
(2)iPS细胞和骨髓造血干细胞中，分化程度较高的是_____。遗传改造的iPS细胞经历的④过程是_____，获得的“A”指的是_____。
(3)图中①过程，需要提供的培养条件有_____、温度和pH、适宜的营养、气体环境等；图中②③过程，将构建好的基因导入细胞时，常采用的方法是_____。构建基因表达载体时，与用同一种限制酶切割目的基因和载体相比，用两种限制酶同时切割目的基因和载体的优点是：_____，从而提高正确的重组率。

4 . 目前用于治疗人类疾病的单克隆抗体大多数是鼠源单抗，人体对鼠源单抗有一定的排斥反应。科研人员根据抗体的结构特点对鼠源单抗进行改造，思路如图甲。获得相关基因后，利用PCR技术进行融合得到目的基因，将其与乳腺细胞表达载体PBCI构建形成重组DNA分子。目的基因、表达载体PBCI的结构如图乙所示。请回答下列问题：

(1)图甲所示的改造思路属于_________工程的范畴，鼠源单抗的______（填“可变区”或“恒定区”）易被免疫细胞识别引发排斥反应。
(2)构建重组DNA分子时，应选择限制酶___________切割目的基因与PBCI载体，以便后续通过_______（填“红色”、“蓝色”或“紫色”）荧光检测筛选。
(3)通常将重组DNA分子导入小鼠的________（填细胞名称），在培养液中加入________以筛选目标细胞，再经过________工程获得大量转基因小鼠。
(4)通过抗原—抗体杂交技术检测转基因小鼠乳汁中的改造抗体水平，发现其含量较低，原因可能是____________、抗体的组装及分泌过程受阻等。

5 . 二化螟的幼虫主要危害水稻的叶和茎，严重影响产量。转Bt基因水稻能一定程度抵抗二化螟的侵害，cryIC基因能促进Bt基因的表达。科研人员采用GALA/UAS基因调控系统构建了转基因抗虫水稻，实验部分流程如图1所示。GALA/UAS系统调控基因表达的机理如图2所示：UAS序列抑制靶基因表达使靶基因沉默，GAL4是一种转录活性因子，可特异性地识别并结合于UAS序列激活UAS下游基因的转录。

   

(1)图1中①②过程所用基因常用PCR扩增的方法获得。PCR的原理是___________；此过程需要用引物，其定义是____________。①②过程前需要构建基因表达载体，此过程需用相同的限制酶切割目的基因与载体，原因是___________。③④过程除了要进行目的基因的检测和鉴定外，还需要进行植物组织培养才能将细胞培养成转基因个体。
(2)现已获得crylC基因、Bt基因和绿色荧光蛋白基因GFP。拟采用农杆菌转化法导入目的基因，图3为Ti质粒的T-DNA片段示意图。若要以GFP基因为标记基因筛选受体细胞，通过特异性启动子-GAL4调控UAS-靶基因的表达，使Bt基因只在杂交子代的叶片和茎鞘中高效表达，则构建UAS-靶基因表达载体时，应将Bt、crylC、GFP三个基因插入到图3所示TDNA中的位置分别____________。（用序号①②③作答）

   

(3)将GAL4转基因个体与UAS-Bt转基因个体杂交得F₁，F₁全表现为抗虫，F₁自交得F₂，F₁植株表现抗虫性状的原因是___________。若F₂中表型及其比例为___________，则GAL4基因和Bt基因插入一对同源染色体上；（假设插入的基因均有效，个体的存活率相等）
(4)采用GAL4UAS系统培育转基因水稻，构建GAL4基因表达载体时采用叶片和茎鞘中特异性表达基因的启动子，可使靶基因只在植株叶片和茎鞘中表达。该技术在提高食品安全方面可能存在一定的意义，具体表现为___________。

7 . 我国科研人员通过基因治疗，成功治愈了全球首例β-地中海贫血症患者。研究人员运用高精准变形式碱基编辑器(tBE)，对患者自体造血干细胞中的单个碱基进行编辑，以重新激活γ-珠蛋白的表达，最终使患者血红蛋白水平恢复正常，过程如图1 所示。相较于图2中基于 CRISPR 技术的β-地贫基因编辑疗法，该方法见效更快、疗效更好，且不引发患者基因组突变或片段缺失。请回答下列问题。

(1)基因治疗中通常用到AAV(腺病毒)等，AAV的作用为____________。
(2)据图2分析CRISPR 技术中gRNA 起____________(填“导向”或“切割”)的作用。
(3)为了检测目的基因是否翻译成γ-珠蛋白，可采用的技术为____________。采用自体造血干细胞编辑移植的优点为_____________(写出1点即可)。
(4)欲验证图1中基因治疗方法对β-地中海贫血症患者的疗效，请写出大致实验思路。(注：使用的测量工具无需说明，β-地中海贫血症志愿者、健康志愿者多人)________

8 . 利用基因工程对重金属污染的土壤进行生物修复是指通过先进的基因工程手段对现有的生物进行改造，以提高耐受重金属胁迫的能力以及对重金属积累的能力。科研人员发现了杨树中存在一种重金属转运蛋白（HMA3）基因。回答下列问题：
(1)若要用PCR技术特异性拷贝“HMA3基因”，需在PCR反应中加入引物，两种引物及其与模板链的结合位置如下图1所示。

若要得到图2所示的5种不同DNA分子，至少要经____轮循环，其中第⑤种DNA分子的个数是____。
(2)研究者将从杨树中克隆的HMA3基因与外源高效启动子连接，导入杨树基因组中（如图3）。

①研究者要想实现上述导入过程，需要借助于三种“分子工具”；分子手术刀、____和____。其中，最后一个上面通常有特殊的____，以便于重组DNA分子的筛选。
②为检测获得的转基因杨树苗中是否含有导入的HMA3基因，同时避免内源HMA3基因的干扰，在进行PCR扩增时，应选择的引物组合是____，作出此选择的理由是____。
(3)与物理、化学方法清除相比，利用转基因植物修复重金属污染土壤的优点有____（答出2点即可）。

10 . 水稻是雌雄同株两性花的植物，花非常小且密集，导致杂交育种工作繁琐复杂。三系法杂交水稻是我国研究应用最早的杂交水稻，由不育系、保持系、恢复系三种水稻培育而成，如下图所示。水稻的花粉是杏可育受细胞质基因（N、S）和细胞核基因（R、r）共同控制，其中N和R表示可育基因，S和r表示不育基因。这四种基因中，R抑制S的表达，仅含有S和r基因的水稻表现为雄性不育，其余基因型均表现为雄性可育。回答下列问题：

(1)水稻细胞中与育性相关的基因型有____种，恢复系的基因型为____，S（Rr）的表型为____。
(2)不育系与恢复系间行种植并单行收获，主要目的是____。
(3)一株基因型为S（rr）的雄性不育系水稻，与基因型为N（RR）的水稻杂交，F₁自交，后代中性状分离比为____。
(4)在三系杂交育种中，选育恢复系非常关键。研究人员发现了几株性状优良且纯度高的水稻植株（代号D），但不能直接作为恢复系。若用基因导入的方法获得理想的恢复系，请简要写出育种方案：____。