1 . （一）我国是生产酱油最早的国家，酱油的酿造主要是利用微生物的酶系的作用，对原料中的蛋白质等物质进行降解，生成特有色、香、味的过程。米曲霉是用于酱油酿造的主要菌种之一，请回答下列选育高产蛋白酶的米曲霉菌株的相关问题。
(1)制作米曲霉孢子悬浮液；选取生长良好的斜面菌种，用______清洗斜面上的孢子，倒入含有玻璃珠的无菌三角瓶中，经______处理分散孢子，制成孢子悬浮液。
(2)筛选目标菌种：用______取适量孢子悬浮液，用涂布器涂布在含有______的平板上，倒置培养一段时间。观察菌落形态特征，测量______和透明圈直径大小，并进行计算。
(3)为选育更优良的米曲霉菌，可对其进行诱变育种：取米曲霉菌液置于培养皿中，用紫外灯照射，其目的是______。
(4)筛选出的优良菌株的遗传稳定性非常重要，可通过观察菌株在______过程中酶活性是否迅速降低，来判断其是否容易退化。
（二）紫杉醇是珍贵的抗癌药物，是红豆杉在不利因素刺激下合成的一种次生代谢物质，难溶于水，主要从红豆杉的树皮中提取，但目前资源短缺，紫杉醇产量低，为了提高产量，某小组欲利用现代生物技术进行相关研究，请回答下列问题：
(5)将红豆杉细胞破碎后______，利用PCR技术扩增紫杉醇合成途径的关键基因A，在相关酶的作用下将基因A和含有卡那霉素抗性基因的Ti质粒连接构建成重组DNA分子并导入农杆菌，在含有______的培养基中筛选出含有重组DNA的农杆菌。
(6)愈伤组织的形成能力与______（A．基因型   B．滋养细胞   C．激素配比）无关。取幼嫩的组织作为外植体，消毒后接种到培养基中形成愈伤组织，转移生长状态良好的愈伤组织到新的培养基进行______以得到生长快速且稳定的愈伤组织。
(7)用含有重组DNA分子的农杆菌侵染愈伤组织，______后进行悬浮培养一段时间，此时细胞的代谢类型为______，培养过程中可通入______来提高产量后，提取紫杉醇并检测含量，筛选出稳定高产的______。
(8)为了培育新品种，可用______的纤维素酶和果胶酶处理柴胡和红豆杉细胞获得原生质体。

2 . 回答下列（一）、（二）小题：
（一）回答与微生物培养及应用有关的问题：
柚子为芸香科柑橘属植物，果肉浓甜，果皮肥厚，人们不仅可以用果肉制备果酒，还可以从柚皮中提取果胶。请回答以下问题：
（1）果酒制作的菌种是酵母菌，在分离和纯化酵母菌时对培养基要采用______灭菌，在用液体培养基扩大培养酵母菌时，需要不断振荡和搅拌，其目的是____________。
（2）制备柚子果酒时，先要对柚子榨汁并调整甜度，与已扩大培养的酵母菌混合装入发酵瓶中，发酵瓶要用带水的弯曲管密封的原因是____________若获得的发酵液中酒精浓度较低，而酵母菌的数量却很多，则导致该结果出现的原因可能是____________________________________。
（3）若用柚子果皮制取果胶，需预先将柚子果皮在沸水中浸泡一段时间，目的是______。研磨、酸萃取获得果胶初提物，并用无水乙醇处理，使其____________，获得果胶干制品。
（4）果胶能与3，5二甲苯酚发生反应，产生红色物质。研究人员利果胶的这一性质，进行果胶含量的测定。测定前，需要用活性炭对果胶进行______处理。测定时，标准液和样液测定时需要保证______（答2点即可）等一致。
（二）回答与基因工程和植物克隆有关的问题：
（1）用化学合成方法得到抗虫基因B，在______酶的作用下，将目的基因与农杆菌的______构建成重组DNA分子。为提高形成重组DNA分子的成功率，可选择______以防止自身环化和反向连接。为提高重组DNA分子导入农杆菌，可以对农杆菌用______处理，提高成功率。
（2）将转化后的农杆菌与水稻幼苗叶片共培养，目的是通过______法，实现让含目的基因的农杆菌进入植物细胞，一段时间后，取出幼苗叶片转移至含抗生素的发芽培养基上，每隔3天换一次培养基，直至培养基不产生____________。待长出______后，转移至生根培养基，经炼苗后即可定植于自然界中生长。

3 . （一）下列是高产蛋白酶的枯草芽孢杆菌的筛选过程，回答下列问题：
(1)配置脱脂牛奶固体培养基时脱脂牛奶需单独用 112℃灭菌的原因是_________，推测还可用 _________方法达到相同的目的。配置该培养基还需调节 pH 为__________。
取三个不同地点的土样，用无菌水稀释。分别取 10^-4、10^-5、10^-6三个稀释度涂布到筛选平板中，每个稀释度做 3 个重复。
(2)将得到的平板 _____________于 30℃恒温培养箱中培养 24h。观察平板上的菌落， 用接种环挑取 _________的菌落中的菌种在脱脂牛奶平板上进行划线分离，以进一步______。最后将分离出的单菌落接种到 _____________（ A.LB 固体斜面培养基   B.LB 固体平板培养基            C.马铃薯蔗糖斜面培养基   D.马铃薯蔗糖平板培养基）中，于 30℃恒温培养箱中培养 24 h 后，放入 4℃冰箱中保存。
（二）番茄黄化曲叶病毒(TYLCV)是一类单链环状 DNA 病毒，能引发番茄黄化曲叶病。检测某番茄幼苗是否感染该病毒，实验人员进行以下操作：①分析 PCR 扩增结果；②从番茄幼苗组织样本中提取 DNA；③利用 PCR 扩增 DNA 片段；④采集番茄幼苗叶片组织样本。回答下列问题：
(3)若要得到正确的检测结果，正确的操作顺序应该是 _________（用数字序号表示）。
(4)步骤②在番茄研磨液中加入 2mol/L 的氯化钠，作用是__________；研磨液中的乙二胺四乙酸二钠（EDTA）的作用是__________。
(5)操作③中使用的酶是_______。PCR 反应中每次循环可分为变性、退火、_______三步。
(6)PCR 扩增得到的产物进行琼脂糖凝胶电泳后的结果如下：

注：M：DNA marker；1-4：空白对照、阴性对照、阳性对照、样品实验中，DNA marker 是一组_____的混合物，起参照作用。______ 是阴性对照组，TYLCV 的 DNA 是阳性对照组。若想利用该样品植株获得无病毒的番茄幼苗，方法是___。

4 . 中医治疗疾病多用复方，三白草（）和鱼腥草（）是同科不同属的两种常见药用植物，二者因疗效相近且具有叠加效应常被用作“药对”，在我国全年可采收两次。研究者欲利用原生质体融合技术将复方的配伍（两种或两种以上药物配合使用）提前到个体生长或生产过程，并实现有效成分的工厂化生产，具体操作如图，①④为过程。
   
(1)取鱼腥草和三白草充分展开的嫩叶片，用70%乙醇和2%的次氯酸钠对其___________（填“消毒”或“灭菌”），每次处理后用无菌水冲洗叶片5次，去除残留于叶片上的药剂，处理后的叶片撕去表皮，切成1mm薄片备用。
(2)过程①通常采用___________酶去除细胞壁获取原生质体，并向三白草和鱼腥草细胞酶解液中分别加入红、绿荧光色素（带荧光色素的原生质体仍能融合和再生）。过程②常利用___________（化学诱导剂名称）诱导融合，随后在荧光显微镜下选择带___________的杂种原生质体。
(3)过程③为___________，该过程一般___________（填“需要”或“不需要”）光照。愈伤组织细胞通常含有___________条染色体。
(4)研人员研究不同的原生质体密度对三白草和鱼腥草原生质体融合率的影响，结果如图2。
   
由图2可知促进三白草和鱼腥草原生质体融合的适宜密度为___________，原生质体浓度过高不利于形成双核异核融合体的原因是___________。
(5)通常情况下，能增加免疫器官重量的物质一般具有一定的增强免疫力的作用。为判断融合体对动物免疫力的影响，科研人员取同种小鼠30只，雌雄各半，随机均分为三组，实验处理如下表。

组别	A组	B组	C组（空白对照组）
实验处理	三白蓝和鱼腥草杂种愈伤组织的蒸馏水提取物	三白草和鱼腥草直接混合后的蒸馏水提取物	__________
	每天一次等量灌胃。连续一周，检测各组小鼠的胸腺重量

①在表格中将C组的实验处理补充完整。
②若实验结果为___________，则支持利用原生质体融合技术将复方的配伍提前并实现有效成分的工厂化生产。

5 . 回答下列（一）、（二）小题：
（一）泡菜是我国的传统食品之一，但制作过程中产生的亚硝酸盐对人体健康有潜在危害。研究发现，有的乳酸菌含高效率的亚硝酸还原酶（NiRs）,能催化亚硝酸盐降解为NO和NH3。
（1）泡菜制作过程产生的亚硝酸盐主要来自某些杂菌对植物细胞中______的还原所得。为了筛选NiRs 高产菌，科研人员在LB固体培养基中添加了______，把相应菌液稀释后涂布接种在平板上，培养24小时后测量______的大小来确定，经扩增培养后还要进行______、耐适度高温等特性鉴定，才可用于生产应用。
（2）通过光电比色法测定并比较“优选”乳酸菌与普通菌株的优势时，若普通菌株泡菜样液OD值不在标准曲线范围时，应采取的解决措施是______。生产上影响泡菜中亚硝酸盐含量的因素除了菌种类型外还有______等（答出两点即可）。
（3）科研人员尝试提取亚硝酸还原酶，利用一定的方法将其固定在______的介质上，成为固定化酶后用于泡菜的“绿色减毒”处理，为确保亚硝酸还原酶的“减毒”效果，在固定化酶处理泡菜的生产过程中尤其要注意保持发酵环境的______条件。
（二）目前国内对水稻不同品种开展了基因工程、组织培养、体细胞杂交等系列育种和栽培研究，请回答下列问题：
（1）科学家把抗盐碱基因 TPSP导入水稻，培育高产的“海水稻”，为使TPSP 基因高效表达，需要对重组载体上目的基因相关的______序列进行修饰；重组载体上缺少标记基因时，可利用______技术对目的基因是否成功导入受体细胞进行高精度的检测。
（2）当籼稻愈伤组织在只含有细胞分裂素的培养基上培养时，出现具有分生能力的绿色芽点，但继续出芽，通常在培养基中添加______，以促进幼苗形成，这是形成植株幼苗的______途径。
（3）系列研究过程中用显微镜可以观察到的现象是______（填序号）。
①绿色芽点细胞排列松散
②刚融合的籼稻和稗草杂交细胞发生质壁分离
③绿色芽点细胞中有叶绿体
④愈伤组织细胞的细胞核大、液泡小
（4）除体细胞杂交之外，让籼稻和稗草在试管内受精，出现胚发育障碍时可进行______，以解决远缘杂交的不亲和性。
（5）胚乳（3n）由一个精子与两个极核（与卵细胞同源）受精发育而成，若用籼稻种子的胚乳诱导愈伤组织，培育三倍体，需适时除胚，以免因胚对营养的吸收影响愈伤组织细胞的____________，还可避免再生苗中混有__________________。

6 . 回答下列（一）、（二）小题
（一）回答与酿酒和制醋有关的问题:
(1)为了获得优良的酿酒红曲霉菌株，将原菌株的孢子诱变处理后制成较稀浓度的单孢子悬液，这样做的目的是在培养时有利于获得_________。
(2)大米经蒸煮、红曲霉菌糖化后，用某念旧酵母进行酒精发酵，发酵完毕后得到新鲜红曲酒，酒中乙醇浓度不超过15%。其主要原因是当发酵液中的乙醇浓度接近15%时，__________

A．乙醇氧化逐渐增强直至平衡

B．葡萄糖分解逐渐增强直至平衡

C．乙醇氧化逐渐减弱直至停止

D．葡萄糖分解逐渐减弱直至停止

(3)已知葡萄糖与蒽酮试剂反应能产生颜色，采用光电比色法测定红曲酒中的葡萄糖含量的步骤如下:第一步，标准曲线的制作。用蒸馏水配置__________，与蒽酮试剂反应后，用比色计测定，并制作以__________的标准曲线。第二步，样品处理。将待测酒样品通过活性炭脱色，其目的是__________。第三步，样品测定与计算。
(4)影响红曲酒风味的主要因素，除了温度、pH、氧气等环境因素外，还有______（答出2点即可）。
(5)在红曲醋生产工艺中，将适量的红曲酒、水、醋化醋杆菌等混合。再添加一定量谷壳糠等制成松散的发酵材料，其目的是__________，以利于醋酸发酵。
回答与植物克隆和动物克隆有关的问题:
(6)利用植物愈伤组织获得再生植株主要有两条途径:一是由愈伤组织的细胞先分化产生芽和根后再形成一个完整植株的__________途径，二是由愈伤组织细胞产生胚状体后再萌发形成完整植株的胚胎发生途径。另外也可不通过愈伤组织阶段而直接采用腋芽带的茎段培养成丛状苗，再诱导生根获得再生植株，其原因是腋芽中存在__________。
(7)利用植物克隆培育新品种，一方面可利用带有目的基因的__________侵染植株，或将目的基因通过__________方法导入植物细胞、组织、器官获得转基因植株，另一方面利用异源植株的__________进行融合产生杂种植株，或利用异源植物在试管内进行__________，对其产生的胚进行培养产生杂种植株。
(8)下列属于植物克隆和动物克隆共有培养方法是____

A．悬浮培养、器官培养	B．贴壁培养、传代培养
C．器官培养、愈伤组织培养	D．原生质体培养、传代培养

7 . 回答下列（一） （二）小题；
（一）酵母菌不仅应用于各种酒类的酿造和面包的制作，而且因富含各种营养物质，可以食用和药用，也可作为饲料及微生物的培养基成分。在利用酵母菌进行酿酒时，若要获得较高酒精度的酿造酒，需要含糖分较高的发酵基质，因此选育耐高糖酵母菌在实际生产过程中具有重要意义。
回答下列与培育耐高糖酵母菌有关的问题。
（1）出发菌株（用来育种处理的起始菌株）的获得：一般从_____
A．腐烂水果堆放处周围       B．肉类加工厂周围       C．生活污水池周围 D．养猪场周围获得土样，用无菌水稀释，备用。
（2）出发菌株的分离与诱变：利用_____将菌液涂布到平面培养基上，分离得到酵母菌株，并接种到液体培养基中进行扩大培养，再用紫外线和亚硝酸钠处理菌液，紫外线的作用是_____；其中扩大培养时需要振荡，目的是_____。
（3）耐糖酵母菌的筛选和检测：
诱变处理的酵母菌等量接种于装有含有_____ 酵母菌培养液的营养瓶中，设计多个重复，每天测量发酵瓶重量，并记录每日失重情况，6天后结束实验，计算总重量。选择失重情况作为检测指标的依据是_____。除了通过失重情况外还可测量_____（答2点即可）确定酵母菌的发酵能力。
显微镜下观察到高糖培养液中能正常发酵的酵母菌大小和形态与低糖培养液中的酵母菌基本一致，说明耐高糖酵母菌能通过_____适应高糖培养基。
（二）科学家将马铃薯胰蛋白酶抑制剂基因（Pin-Ⅱ）通过农杆菌导入杨树细胞，培育成了抗虫杨树。图中Ap^r表示氨苄青霉素抗性基因，Ne^r表示新霉素抗性基因，箭头表示识别序列完全不同的4种限制酶的酶切位点。回答下列问题；
（1）过程①应该选择_____（限制酶）作用于含目的基因的 DNA 和Ti质粒。
（2）Ti质粒是基因工程中常用的运载体，农杆菌上Ti质粒上T-DNA区段的作用是_____。②过程完成后，为使CaCl₂处理过的农杆菌恢复正常状态，可加入_____。
（3）过程③之前需要对农杆菌进行筛选，可以利用下述_____
A．只用含氨苄青霉素的培养基B．只用含新霉素的培养基C．先用含氨苄青霉素的培养基，再用含新霉素的培养基D．先用含新霉素的培养基，再用含氨苄青霉素的培养基
培养基筛选出含重组Ti质粒的农杆菌，还可以采用_____方法鉴定重组 DNA分子是否导入到农杆菌。被侵染的愈伤组织需要_____后再进行培养，否则最终得到的抗虫植株容易长瘤。
（4）通过调节营养物质和植物生长调节剂的适当配比，可以诱导愈伤组织再生出抗虫杨树。若愈伤组织中缺乏_____将无法再生形成植株。图中培育抗虫杨树新品种的整个过程就是_____技术。

8 . (一）科学家用植物细胞杂交方法，将番茄的原生质体和马铃薯的原生质体融合，成功地培育出了“番茄-马铃薯”杂种植株，如图1所示，其中①～⑤表示过程，英文字母表示细胞、组织或植株。育种工作者还利用番茄进行了如下三组实验如图2。据图回答下列问题：

(1)实现过程②的原理是_____________，从④到⑤需要更换新的培养基，原因是_____________。
(2)过程②后，在光学显微镜下观察融合的活细胞中有供体的_____________（细胞器）存在，这一特征可作为初步筛选杂种细胞的标志。
(3)若番茄细胞内有m条染色体，马铃薯细胞含n条染色体，则“番茄-马铃薯”细胞内最多含_____________条染色体；若杂种细胞培育成为“番茄-马铃薯”植株为四倍体，则此杂种植株的花粉经离体培育得到的植株属于_____________倍体植株。
(4)如果形成c细胞的a、b细胞都是番茄细胞，那么更简单的得到番茄植株f的处理方法是_____________处理。
（二）随着新冠疫情的持续，人类消耗了大量的一次性口罩，这些口罩不及时处理会对环境造成一定的污染。某科研人员欲筛选出能高效降解一次性口罩（主要成分是由C、H两种元素组成的聚丙烯纤维）的细菌，设计了如图所示的流程。回答下列问题：

(5)筛选目的菌的培养基应以______为唯一碳源。
(6)图中“甲”指的是_______________，目的是____________ 。
(7)已知目的菌分解聚丙烯纤维需要多种酶的共同参与，如果用凝胶色谱法分离其中的酶，相对分子质量小的酶移动速度______。目的菌比酶分子大得多，工厂化降解聚丙烯纤维时，通常采用______法来固定目的菌。影响目的菌降解聚丙烯纤维效果的因素有温度、pH以及_________________等（答出两点即可）。
(8)若在3个细菌培养基平板上均接种稀释倍数为10⁵的土壤样品0.1mL，培养一段时间，平板上菌落数分别为35个、33个、34个，则可推测每克土壤样品中的细菌数为______个。运用这种方法统计的结果往往较实际值偏小，原因是_______________。

9 . 回答下列（一）、（二）小题：
（一）海南粗榧是一种濒危植物，其产生的三尖杉碱对急性及慢性粒细胞白血病和恶性淋巴病有较好的疗效。请回答有关问题：
（1）测定不同来源海南粗榧植株的三尖杉碱含量：精确称取10mg三尖杉碱标准品，溶于甲醇并________至5ml容量瓶中，配制成2mg/ml的母液，再将母液分别________成一系列浓度的工作液各2ml，加入显色剂，测定光密度值（OD值），绘制标准曲线。如果实验中发现OD值太大不利于作图，应该________（增大、减小）光程。
（2）在对海南粗榧进行组织培养的时候，首先配制MS培养基，其中CuSO₄提供________（A．大量元素   B．微量元素   C．有机成分   D．能源），在MS培养基的基础上再配制发芽培养基和生根培养基，分装到三角瓶中，加上封口膜后在________压力下灭菌20分钟待用。
（3）三尖杉碱属于________代谢产物，可以通过二段法进行细胞悬浮培养，即细胞系先在生长培养基中培养一段时间以累积________________，再转入生产培养基促使细胞大量合成有效三尖杉碱，从而实现工业化生产。
（二）研究人员利用基因敲除技术将猪的肌生成抑制蛋白基因敲除，从而得到了高骨骼肌含量的克隆猪。请回答有关问题：
（1）常用基因敲除技术是通过同源重组将外源基因定点整合入靶细胞基因组上某一确定的位点，以定点修饰改造染色体上某一基因。相对传统的转基因技术，该基因敲除技术的最大优点是________________。要实现敲除肌生成抑制蛋白基因的目的，首先要构建替换型打靶载体，该过程中需要的工具酶有________________。
（2）将替换型打靶载体通过显微注射法导入猪胚胎干细胞，胚胎干细胞是从着床前胚胎分离出的________的细胞，它具有向各种组织细胞分化的潜能。培养猪胚胎干细胞时，首先要在培养皿底部制备一层细胞，这层细胞一般是________________。
（3）筛选出靶细胞，导入猪的________中，再将其植入代孕猪体内，使其发育成嵌合体猪，再经过回交、筛选就可以得到肌生成抑制蛋白基因敲除纯合体。为了快速扩大基因敲除猪的种群，除进行有性生殖外，还可以采取胚胎分割和________技术。
（4）为证明肌生成抑制蛋白基因敲除猪的表现型改变确实是由于敲除了该基因的缘故，可以通过导入肌生成抑制蛋白基因或者直接注射________，如果猪表现型转为正常，说明确实是由于敲除了肌生成抑制蛋白基因的缘故。

10 . 回答下列（一）、（二）小题：
（一）回答与筛选高产蛋白酶菌株实验有关的问题：
（1）在配制用于初筛的牛奶培养基时，需要将奶粉用水溶解后单独灭菌，置于高压灭菌锅中在600 g/cm²压力下灭菌30 min，设定该压力的目的是____________。
（2）从自然界中获取合适的土壤样品后，先要称取适量样品加入适宜的液体培养基中进行富集培养，原因是____________。
（3）将富集培养并经鉴定的菌悬液经____________后涂布到牛奶平板上，在适宜条件下培养一段时间后，观察并测量____________，以初步筛选蛋白酶高产菌株。
（4）初筛的蛋白酶高产菌株经分离纯化后需进行鉴定，常利用____________染色法将细菌染色，在显微镜下观察颜色；也可直接观察____________的大小、形状等特征来确定菌株的类型。 
（5）鉴定蛋白酶活力的基本原理是：用蛋白酶处理酪蛋白可释放酪氨酸，后者与Folin试剂在碱性条件下反应生成蓝色化合物，可通过____________法测定并比较酶活力大小。 
（6）为保存菌株，用____________法将菌种接种至试管斜面上，于30 ℃培养24 h，置于冰箱中保存。 
（二）红豆杉富含紫杉醇，是一种重要的抗癌药物。请回答与红豆杉组织培养及转基因有关的问题：
（1）在进行红豆杉愈伤组织诱导和培养时，最好取春季新长出的茎叶，经____________处理后才能接种到诱导培养基中进行培养。形成的愈伤组织细胞在显微镜下观察通常是不定形态的，原因是____________。为增加愈伤组织的数量，可以将培养瓶中的愈伤组织切下，接种至新的相同培养基上进行____________。 
（2）可从固体培养基中筛选生长良好的愈伤组织，接种至含液体培养基的三角瓶中在摇床上振荡培养，细胞的生长速度和紫杉醇含量和培养的温度、pH、光照条件、培养基中的营养物质及细胞遗传特性有关外，还受____________的影响。在植物细胞不断再培养的过程中容易发生____________（可遗传变异类型）等变化，这会导致细胞全能性的丧失。 
（3）将外源基因导入植物细胞有多种途径：以经改造的农杆菌Ti质粒为____________，通过寄主感染受体植物的途径将外源基因转入受体细胞；也可通过____________将外源基因直接导入受体细胞；还可以将外源DNA包裹在人工合成的脂质体中，通过与____________融合完成细胞的转化。