23. 透明质酸(HA)又称玻尿酸,是一种具有高黏度氨基多糖,也是重要的医学材料和化妆品添加原料。枯草芽孢杆菌无透明质酸合成酶(HAS),但含有HA代谢的其它途径,而动物病原体链球菌含有HAS的基因(H基因)。研究者通过基因工程来改变枯草芽孢杆菌代谢通路,以实现枯草芽孢杆菌生产HA。
(1)目的基因的获取和扩增:链球菌破碎后提取DNA,经
______酶切割获取H基因。PCR扩增目的基因,需要根据H基因设计合适的引物,是由于DNA聚合酶发挥作用时需要引物参与形成
______作为核苷酸缩合作用的起点;DNA聚合酶在延伸子链时需要
______把核苷酸加到
______端。
(2)表达载体的构建:下图为H基因与p质粒示意图,其中H基因以a链为转录模板链。为通过添加诱导剂来控制H基因的表达,研究者选择了含木糖诱导型启动子的p质粒。为了使下图中酶切后的H基因按照正确的方向与p质粒连接,p质粒位点1和2所对应的酶分别是
______。酶切后加入
______酶催化重组质粒形成。
(3)表达载体的导入与筛选:将构建好的重组质粒转入经
______处理的枯草芽孢杆菌,在含
______的培养基上筛选,得到枯草芽孢杆菌A。
(4)菌种的扩大培养:配制
______(填“液体”或“固体”)培养基,成分有水、无机盐、蛋白胨和酵母提取物,其中蛋白胨为微生物生长主要提供
____________;调整pH;灭菌;枯草芽孢杆菌A接种到摇瓶培养。
(5)大型发酵:进行现代工业发酵时,在发酵罐加入适宜的培养基外,还需严格控制
______等发酵条件。经扩大培养的枯草芽孢杆菌A接种定时间后添加
______,诱导合成HA。HA对枯草芽孢杆菌来说属于
______(填“初生代谢产物”或“次生代谢产物”)。
(6)产品输出:发酵液中大部分为水,发酵产物浓度较低;发酵液中悬浮固形物主要是菌体和蛋白质的胶状物,故最后对发酵产物进行
______,获得所需产品。