1 . 镰刀型细胞贫血症是一种常染色体隐性遗传病，是由正常血红蛋白基因突变为镰刀型细胞贫血症基因引起的，相关片段如下图。对胎儿基因检测的主要原理是：MstII限制酶处理扩增后的DNA；加热使被酶切的DNA片段解旋，用荧光标记的CTGACTCCT序列与其杂交；凝胶电泳分离。下列叙述正确的是（       ）

   

A．PCR扩增时预变性时间较长是为了使模板DNA充分变性

B．需要设计能与血红蛋白基因结合的双链DNA作为PCR引物

C．电泳中需要加入亚甲基蓝作为电泳指示剂

D．若出现3条电泳条带，可判断该个体为杂合子

2 . 为使甘蓝具有抗除草能力，科研人员将除草剂草甘膦抗性基因转入甘蓝植株，获得抗草甘膦转基因甘蓝。（见图1，注：BamHI识别的序列是G↓GATCC；BgⅢ识别的序列是A↓GATCT，EcoRI识别的序列是C↓AATTC）

   

(1)利用PCR扩增草甘膦抗性基因时，需要在引物的_____（填“3'端”或“5'端”）添加限制酶识别序列，若产物中除了目的基因外有其他DNA片段存在，原因可能是_____（答2条）。
(2)构建表达载体时切割质粒应选择_____酶切。酶切后的目的基因存在正向与反向两种连接方式，可用_____酶对两种重组质粒进行剪切，再通过琼脂糖凝胶电泳技术分析产物大小进行区分，电泳结果出现长度为_____的片段即为所需基因表达载体。
(3)步骤②将重组质粒与经_____处理农杆菌的混合，完成转化后先置于_____培养基中培养，其目的是_____。再将菌液涂布在含有抗生素的固体培养基中进行筛选。步骤③将农杆菌与甘蓝愈伤组织共培养后，在培养基中添加_____以便筛选出含目的基因的甘蓝愈伤组织。
(4)基因芯片技术是一种能有效地对转基因作物进行检测的新技术，通常被检测的特定DNA序列包括两类：一类是非目的基因序列，主要为载体上通常具有的各种组成元件；另一类则是目的基因序列本身。使用方法如下：第一步，针对待测的特定DNA片段设计引物，扩增出的特定DNA片段带上标记制成探针，经变性后通过芯片点样仪固定到杂交膜上，再经过一定的处理，便得到可用于检测的DNA芯片（见图2）；第二步，从待测植物中提取DNA作为模板，加入引物进行扩增；第三步，将扩增产物经过变性处理后铺于芯片表面，放入杂交盒中，在适宜条件下进行杂交；第四步，待反应结束后，对芯片进行清洗等处理，用仪器检测芯片上的杂交结果。

   

利用基因芯片可检测特定DNA序列依据的是_____原则。对抗草甘膦转基因甘蓝进行检测的基因芯片的阵列设计为：第1列为空白对照，第2列固定甘蓝植株的内源基因作为阳性对照，第3列固定与甘蓝DNA序列高度_____（填“同源”或“非同源”）的DNA片段作为阴性对照，第4~6列可分别固定_____、_____和潮霉素抗性基因进行检测，每列重复多次以保证结果的准确性。若该基因芯片检测有效，转基因甘蓝的样本在芯片的第_____列上均应出现检测信号。
(5)叶绿体转化是植物基因工程的新热点，叶绿体的诸多特点为叶绿体转化提供优势，如叶绿体基因组小，功能清晰，使基因操作方便；叶绿体细胞具有自我复制功能，一个植物细胞可含有多个叶绿体，每个叶绿体中含有多个基因组，可大大提高_____；另外，叶绿体基因位于细胞质中，可有效避免_____。

4 . 抗癌药紫杉醇是从红豆杉树皮中提取的生物活性物质，由于红豆杉生长缓慢，易发生立枯病、茎腐病等病害，使紫杉醇的提取受到极大限制。科研人员利用组培技术提高了紫杉醇的产量，生产流程如下：

   

(1)外植体常选取红豆杉的茎尖，其优点有______。
所培养的细胞系不直接来自外植体而是来自愈伤组织，依据是______。
(2)紫杉醇能否实现工业化生产，关键是选择高产细胞系，研究发现，继代培养的细胞保持愈伤组织特性，既能实现高产又能保持生产特性的稳定性，为达到这一目的，关键是培养基的配制需满足：①__________________，②适合原种生长，防止细胞因培养条件改变发生____________，造成细胞系衰退。
(3)为选育高产细胞系，某研究小组用南方红豆杉不同外植体进行悬浮培养实验，结果如下图：

   

液体悬浮培养时接种量不能过高，否则可能引起培养体系中的____________不足，造成细胞生长缓慢。实验表明，液体培养条件下，应该选择____________来源的红豆杉细胞系，继代培养到第____________代提取紫杉醇，可获得最高产量。
(4)紫杉醇是红豆杉对环境的一种适应产物，试验表明，优化细胞生长环境，虽然提高了细胞生长速率，却导致紫杉醇含量降低。研究小组发现植物体内普遍存在内生真菌，它们也可产生紫杉醇，这一发现开辟了用微生物发酵技术生产紫杉醇的新途径，弥补了植物组培技术的不足。请你帮助该小组完成下列实验：
I.完成菌株的分离与纯化：
取红豆杉的老树皮，____________后，削去表层，从内部切取小块，斜插入半固体培养基中，28℃培养3~7d，挑取向培养基基质生长的菌丝体于固体培养基中，纯化2~3次。培养时，通常会添加马铃薯、蔗糖和一定浓度的青霉素，其目的是________________________。
II.菌株的鉴定
①形态学鉴定：将纯化的内生菌种进行发酵培养，通过液相色谱法检测发酵产物，筛选______真菌，再将分离的菌株置于固体培养基上，经培养后观察菌落形态特征。
②分子生物学鉴定：提取菌株基因组DNA作为______，扩增ITS序列（存在于真核生物中的一段rDNA转录间隔区），被广泛应用于真菌分类、鉴定，通过______检测并回收扩增产物，将纯化后的产物进行______，与基因数据库比对分析。
III.发酵培养与产品鉴定
内生真菌脱离植株后，由于生活环境改变，代谢水平受到影响，因此培养基的选择尤为重要。通过查阅资料推测通过添加______等物质能使紫杉醇产量提高。

5 . 水蛭素是一种小分子蛋白质，对凝血酶有极强的抑制作用，是迄今为止所发现的最强凝血酶天然特异抑制剂，在心脑血栓疾病治疗中均有显著作用。天然水蛭素主要从医用水蛭的唾液腺中分离出来，产量有限，因此利用基因工程制备重组水蛭素成为抗血栓治疗的研究热点之一。基因工程中所用的质粒图谱如下图。Sac Ⅰ、Hind Ⅲ和BamH I为三种限制性内切核酸酶，（图中限制酶的识别序列和切割后的黏性末端均不同）回答下列问题：

(1)获取目的基因：从________细胞中获取mRNA。已知水蛭素基因的α链为转录的模板链，在设计用于cDNA扩增的特异性引物时，需要在引物______（A/B/C/D）的______端添加BamH I识别序列和强启动子序列。
(2)构建重组质粒：对质粒选择用BamH I、Hind Ⅲ 限制酶进行酶切，与目的基因构建重组DNA分子，目的基因和质粒可以“拼接”成功的原因是_____________。用Sac Ⅰ酶切构建后的重组DNA,经凝胶电泳确定重组DNA 的片段长度，电泳过程中观察到_________________，关闭电泳仪电源。
(3)导入大肠杆菌；为提高大肠杆菌的转化效率，可将大肠杆菌放于低温、_____________（“高”或“低”）浓度的CaCl₂溶液中，可使细胞膨胀通透性增加，制备成_____________，促进重组质粒的转入。
(4)筛选与检测：将大肠杆菌培养在添加_____________的LB固体培养基上，可筛选得到转入重组质粒的大肠杆菌。还可以用_____________技术更加精准地鉴定大肠杆菌细胞中是否转入了水蛭素基因。
(5)生产：在规模化的发酵生产中，需监控发酵过程的营养供给、_____________(写2点)等变化。采用低温（4℃）离心、萃取方法分离和提纯水蛭素，低温处理的目的是_____________，其理由是_____________
(6)通过上述方法生产的水蛭素的抗凝血活性低于天然野生型水蛭素，可通过大引物PCR定点诱变改良基因。需要进行两轮PCR（PCR1和PCR2）见下图。在PCR1中，至少需要经过___个循环才能获得图中所示大引物。在PCR2中，若要获得带有突变位点的改良基因，则应选择的引物是___（填“①”或“②”）。

6 . 研究显示，结肠癌等多种恶性肿瘤细胞会表达hCGβ蛋白，这与肿瘤的发生及转移可能有一定关系，通过各种生物反应器研发抗hCGβ蛋白已成为近年来肿瘤治疗领域热点问题。某制备抗hCGβ疫苗的流程如图1所示，其中启动子有物种特异性。

注：序列甲（320bp）指导合成的信号肽，能指引翻译后的多肽进入内质网腔；AXO1为甲醇诱导型的真核启动子，有甲醇存在的环境下才会启动表达。
回答下列问题：
(1)构建重组载体。图1中获取抗β基因的方法属于______，将抗β基因与甲序列一起构建形成融合基因，并与线性质粒连接。
(2)大肠杆菌转化。过程Ⅱ将环化质粒导入受体细胞，然后涂布于含氨苄青霉素的平板，在恒温培养箱中______培养，以利于获得单菌落，筛选分离出含抗β基因的大肠杆菌。
(3)鉴定融合基因。为鉴定抗β基因与甲序列是否融合成功，提取大肠杆菌的______作为模板，设计相应引物对融合基因进行PCR并电泳。在PCR过程中，每一个循环均包括变性、______三个阶段。为使扩增产物能被限制酶用于后续实验，应在引物5′端添加______，电泳时将样品与______混合后加入加样孔。凝胶中加样孔的一端朝向电泳槽的______（正极/负极）。电泳后得到图2所示结果，根据______，可推测PCR产物的长度，因此可判断______号泳道的样品符合要求。

(4)导入酵母菌。过程Ⅳ—Ⅴ中，将处理后的酵母菌接种于培养基中，该培养基不需要添加的成分有______（A．组氨酸   B．甲醇   C．无机盐   D．琼脂），此培养基上形成的母菌菌落即为目的菌株，此步骤不能通过培养基中添加氨苄青霉素作为筛选条件获得目标菌株的原因是______（答出两点）。
(5)基因表达检测。将酵母菌接种后于______上振荡培养，将培养物离心后分成细胞和培养液两部分，将细胞用缓冲液重新悬浮，并______处理后，再次离心取上清液。用hCGβ蛋白对上清液和之前获得的培养液通过______技术进行检测，若两组均呈阳性，则说明基因在酵母菌中______。
(6)发酵罐生产。为了解发酵罐中酵母菌数量，取5g皮渣加入45mL无菌水中，按照此法，梯度稀释至104倍。取0.1mL稀释液涂布计数，三个平板中菌落数分别为56、62和56，则此时每克皮渣酵母菌数量是______个。
(7)蛋白活性检测。已知DNS在90℃以上可与还原糖发生显色反应，将β蛋白与淀粉酶制成β-酶复合体，β-酶复合体蛋白与抗β蛋白结合后会遮盖复合体空间构象，使酶无法正常执行功能。向离心管加抗β蛋白、β-酶复合体反应10min，再加入淀粉反应10min，立刻沸水浴处理2min，此时沸水浴的目的是______。随后加入DNS并沸水浴处理10min，通过测定反应液的颜色变化，推测抗β蛋白的活性。颜色反应越深，可以反映抗β蛋白的活性越______。β-酶复合体需要在低温下保存，原因是______。

7 . 某病毒对动物养殖业危害十分严重。我国学者拟以该病毒外壳蛋白A为抗原来制备单克隆抗体，以期快速检测该病毒，其主要技术路线如图1所示。回答下列问题：

(1)获取基因A：获取该基因的常用方法是先建立___，从中“钓取”相应基因克隆片段后进行PCR扩增，扩增时添加dNTP的目的是___，同时缓冲液中通常还需加入___以激活耐高温的TaqDNA聚合酶。
(2)构建重组表达载体：为将基因A与图2所示载体相连（LacZ基因编码产生β-半乳糖苷酶，可催化无色物质X-gal产生蓝色物质使菌落呈蓝色），需在基因A两端添加___限制酶识别序列，应添加在引物的___（填“5’”或“3’”）端。为确保基因A定向连接到质粒中，需对重组DNA进行PCR检测，应选择图3中的引物组合为___。

(3)工程菌转化：为了便于筛选，选择对___敏感且具有___缺陷的受体细菌进行转化。转化前用低浓度的CaCl₂溶液处理受体细菌使之成为___，可提高转化效率，转化后的细菌用___法接种培养，挑选___的菌落进行纯化，获得转基因工程菌。
(4)诱导融合并筛选杂交瘤细胞：添加脂溶性物质PEG可促进细胞融合，其中PEG对细胞膜的作用是___。在筛选产生特定抗体的杂交瘤细胞时，需将初步筛选获得的细胞群进行___后转移到多孔细胞培养板上进行___培养，各孔上清液中细胞分泌的抗体可利用___技术检测。
(5)杂交瘤细胞培养：血清是杂交瘤细胞发生支原体污染的最主要来源之一，无血清培养基越来越受到重视，此类培养基中应添加水、无机盐、糖类___等成分（写出2点）。大规模培养杂交瘤细胞时，可将其接入发酵罐中进行产品生产，发酵过程中需控制___等条件适宜（写出2点）。