23. 下图1是QuickChange定点突变技术及副反应的示意图,其中的F和R代表引物,其上含有突变的碱基序列。请回答下列问题。
(1)图中PCR反应体系进行时,除需要加入引物F和引物R、原始质粒、缓冲液外,还需加入的物质有
___________。
(2)已知DpnI酶是一种限制酶,能特异性识别腺嘌呤甲基化的GATC序列。由图可知,在原始质粒上有
____________(选填“0”“1”或“很多”)个DpnI酶的切割位点。为成功获得带缺刻突变质粒,应对来自大肠杆菌的原始质粒进行的处理是
___________。
(3)图中的DH5a细胞是处于
___________的大肠杆菌,对带缺刻突变质粒进行修复时需要添加
___________酶。图中副反应发生的原因是新链退火时,两条新链互补配对,互为复制的
___________,扩增出非目的片段。该技术除了图示副反应外,还存在的不足是
___________。
(4)研究人员对QuickChange定点突变技术进行了改进,在两个PCR体系中分别加入单引物F或R,具体过程下图2。
①单引物PCR1过程中,假设原始质粒有n个,每循环一次产生____________个双链DNA,循环30次需要____________个引物F。
②与QuickChange定点突变技术相比,单引物PCR除了能解决第(3)问中的不足,还存在的优点是___________