1 . 植物内生菌是一定阶段或全部阶段生活于健康植物的组织和器官内部的真菌或细菌，普遍存在于高等植物中。
(1)放线菌也是一种常见的内生菌，能抑制病原菌的生长。研究人员利用两种不同类型的放线菌获得新型工程菌，过程如下：
   
收集上述两种菌丝体，加入________（填“纤维素酶”或“溶菌酶”）处理，分离原生质体，将两种原生质体悬液等量混合，加入适量促融剂处理一段时间。终止反应并洗涤后，取一定量混合液接种于________（填“固体”或“液体”）培养基中培养。根据菌落特征，选出性状稳定的融合菌株。
(2)某真菌的w基因可编码一种高效降解纤维素的酶，已知图中w基因转录方向为从左往右。为使放线菌产生该酶，以图中质粒为载体，进行转基因。
   

限制酶	BamH I	EcoR I	Mfe I	Kpn I	HindⅢ
识别序列和切割位点	G↓GATTC	G↓AATTC	C↓AATTG	GGTAC↓C	A↓AGCTT

①限制酶主要是从________中分离纯化出来的。应使用限制酶________切割图中质粒，使用限制酶________切割图中含w基因的DNA片段，以获得能正确表达w基因的重组质粒。
②与质粒中启动子结合的酶是________。启动子通常具有物种特异性，在质粒中插入w基因，其上游启动子应选择________启动子（选填“植物”、“真菌”、“放线菌”）。
③W基因转录的模板链是________。利用PCR技术对W基因进行扩增的原理是________，子链的延伸方向是________。
④研究人员欲对W基因的mRNA进行RT-PCR，已知其mRNA的序列为5'-UGAACGCUA…（中间序列）…GUCGACUCG-3'。为了便于将扩增后的基因和载体成功构建成重组质粒，用于PCR扩增的引物应为________。
A.5'-TGAACGCTA…        B.5'-CGAGTCGAC…
C.5'-GAATTCTGA…        D.5'-AAGCTTCGA…

2 . 工程菌的高密度发酵受到溶氧等多种因素的制约。透明颤菌血红蛋白（vgb）能从微氧环境中摄取氧，提高胞内有效氧浓度，从而促进低溶氧条件下细菌的生长繁殖。研究人员根据Genbank公布的vgb基因及其启动子的序列信息，人工合成目的基因（含vgb启动子Pvgb及vgb编码区DNA片段），插入克隆载体质粒pUC57得到质粒pUC57-vgb。从pUC57中回收vgb启动子及编码区片段，再插入表达载体pET28a，得到重组质粒pET-vgb。将重组质粒导入大肠杆菌即得到适合低氧发酵的工程菌。部分过程如下图1所示，回答下列问题：
   
注：M为指示分子大小的标准参照物；小于0.2kb的DNA分子条带未出现在图中
(1)启动子Pvgb受环境中溶氧调节，当溶氧跌至20%以下时，Pvgb激活，合成vgb，这种启动子称为______________。
(2)提取pUC57-vgb，通过PCR技术扩增目的基因。扩增时需在两种引物的_______（填5′或3′）端分别添加BamHI和HindIII识别序列。PCR反应体系中需加入Mg²⁺离子，目的是____________________________。
(3)将构建好的重组质粒导入大肠杆菌时，需要用Ca²⁺处理大肠杆菌细胞，使细胞处于______________的生理状态。
(4)将转化后的大肠杆菌接种在含卡那霉素的培养基上进行培养，随机挑取菌落（分别编号为1、2、3、4）培养并提取质粒，用BamHI和HindIII两种限制酶进行酶切，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳分离。电泳结果如图2所示。
①在凝胶中DNA分子的迁移速率与____________________________（列举两点）有关。
②含目的基因的重组质粒很可能是_______号菌落的质粒。
(5)为进一步验证低氧发酵的工程菌是否构建成功，将（4）中挑选的菌种接种到液体培养基中培养，同时培养_______菌种作对照。在摇床上_______（填“低速”或“高速”）震荡培养，一段时间后检测菌体密度。

3 . 氢能是潜力巨大的可再生清洁能源。利用产气肠杆菌制氢具有条件温和、环保等优点。E.as菌是产氢率较高的菌种，为进一步提高其产氢率，科研人员开展了相关研究。回答下列问题。
(1)为获得 E.as菌纯培养物，可采用________法进行纯培养。在培养过程中，设置未接种的平板作为对照，这样做的目的是________。
(2)为确定 E.as菌产氢率的最适温度，某同学进行了相关实验，请简要写出实验思路。________
(3)E.as菌细胞中hycA基因表达会抑制产氢代谢，科研人员通过同源重组方式使hycA蛋白失活，获得了产氢率更高的工程菌E.as⁃A，其技术流程如图所示。
   
①过程I中可采用________法处理 E.as 菌，以促进DNA片段P的导入 。
②过程II中，同源重组导致 hycA蛋白失活，其机制是_______。依据基因工程原理，采取其他手段也可达到同样的失活效果，可采用的其他手段有_______（写出一项即可）。
③过程Ⅲ应将菌种接种到含有________的培养基上进行筛选，最终获得E.as-A工程菌。

4 . 近期在“科学号”考察船对南中国海科考中，中国科学家采集了某海域1146米深海冷泉附近沉积物样品，分离、鉴定得到新的微生物菌株——拟杆菌新菌株并进一步研究了其生物学特性。有关说法错误的是（　　）

   

A．培养基接入沉积物样品后，需要在低温厌氧培养一段时间才能获得含拟杆菌的培养物

B．在以纤维素为唯一碳源时可以得到纯种培养的拟杆菌新菌株

C．将采集的样品置于各种培养基中培养，仍有很多微生物不能被分离筛选出来，推测其原因可能是某些微生物只有利用深海冷泉中的特有物质才能生存

D．藻类细胞解体后难降解的多糖物质，通常会聚集形成碎屑沉降到深海底部，推测拟杆菌新菌株为异养生物，作为分解者起作用

5 . 下列关于生物实验的叙述正确的是（       ）

A．施旺、施莱登运用不完全归纳法得出一切动植物都由细胞发育而来

B．果酒发酵过程中，每隔12h左右打开瓶盖，释放酵母菌发酵产生的CO2

C．拜尔的实验在黑暗中进行是为了排除光照对胚芽鞘尖端合成生长素的影响

D．分别用含有35S和32P的两种培养基培养细菌，再用上述细菌分别培养病毒，检测子代病毒的放射性可区分是DNA病毒还是RNA病毒

6 . 已知大肠杆菌菌株A的基因型为met^－bio^－thr⁺leu⁺thi⁺，菌株B的基因型为met⁺bio⁺thr^－leu^－thi^－（一表示不能合成，+表示能合成，met、bio、thr、leu、thi分别表示甲硫氨酸、生物素、苏氨酸、亮氨酸、硫胺素）。

(1)若用基本培养基（营养缺陷型菌株不能生长）单独培养菌株A和B，二者均不能生长，但在完全培养基中可以生长；若将菌株A和B在完全培养基中混合培养，再取菌液涂布在基本培养基上，培养平板上会出现菌落。为解释该现象，研究者提出了两种假说：
假说1：在混合培养过程中一些物质从一个菌株中释放出来后被另一个菌株吸收；
假说2：在混合培养过程中，两种菌株发生了杂交，出现了基因重组。
①为判断假说1是否正确，用如图1所示的装置开展实验。一段时间后取U形装置滤片两侧的菌液，分别涂布于____（填“基本培养基”或“完全培养基”）上。若实验结果显示______，则假说1不成立。
②为验证假说2是否正确，可对图1装置所作的改进措施为_____，其余实验操作不变。
(2)菌株A和菌株B又分别有链霉素敏感（str^s）和链霉素抗性（str^r）两种类型，链霉素会抑制str^s菌株的细胞分裂，导致无法完成基因重组。选取相应菌株开展杂交实验，并取菌液涂布于不同的培养基上，实验结果如表所示。

	不含链霉素的基本培养基	含链霉素的基本培养基
实验甲（Astrs×Bstrr）	有菌落	有菌落
实验乙（Astrr×Bstrs）	有菌落	无菌落

①实验甲、乙在不含链霉素的基本培养基上均有菌落出现的原因是____。
②据结果分析，两种菌株在杂交中的作用不同，其中菌株____（填“A”或“B”）相当于雌性个体，即作为遗传物质的______（填“供体”或“受体”）。
(3)进一步研究表明，某种菌株能够作为遗传物质供体是因为含有一种微小质粒F因子。含有F因子的菌株（F⁺菌株）可向不含F因子的菌株（F^—菌株）转移F因子中的DNA，且F因子也可整合到细菌拟核DNA中成为Hfr菌株。Hfr可从任意起点向F^—转移拟核DNA，根据F^—菌株中出现Hfr菌株基因的时间，可确定拟核DNA上不同基因的位置。请根据表中相关实验结果，判断三种基因在图2圆圈上的相对位置：trpA__________、hipA__________、polA__________（填“①，②或③”）。

7 . 樱桃冠病是根癌农杆菌引起的樱桃树疾病。科研人员利用根癌农杆菌作为一种天然高效的转基因运载体，将人工合成的新冠病毒（SARS-CoV-2）基因组序列导入本氏烟草细胞，经植物组织培养后从叶片中提取、纯化病毒样颗粒，用于新冠疫苗的生产，其过程主要包括以下五个步骤。
(1)步骤一：取樱桃树病变枝条的幼嫩瘤体1g经______处理捣碎，加入______稀释后，用______法获得单菌落、经筛选鉴定获得根癌农杆菌。
(2)步骤二：通过人工合成新冠病毒基因组序列应包含______（A.全部遗传信息   B.遗传物质复制相关蛋白的基因   C.衣壳的部分结构蛋白基因）。通过PCR获取该基因时需设计两种引物，引物间不能碱基互补的原因是______。目的基因应插入根癌农杆菌的Ti质粒的______（A.复制起点   B.Ti质粒上的任意区域   C.T-DNA区域）
(3)步骤三：将重组质粒与经______处理的根癌农杆菌混合，完成转化后还需控制温度进行______培养，使______，再将菌液涂布在含特定抗生素的培养基上培养，挑取菌落进行______鉴定后扩大培养待用。
(4)步骤四：取本氏烟草细胞经消毒后与待用菌液共同培养，目的是使______，为提高效率，可采用哪几项措施？______（A.不时摇动培养液   B.缩短培养时间   C.控制菌液中农杆菌浓度   D.降低培养温度）。
(5)步骤五：将处理后的本氏烟草细胞放在含______的培养基中除菌处理后，诱导生成根、芽，通过______途径获得转基因本氏烟草，并通过______的方法检测本氏烟草叶肉细胞中病毒样颗粒。

8 . 土壤中95%以上的磷为植物很难利用的无效磷。解磷菌能够将磷矿粉等无效磷转化为植物易利用的速效磷。为研究解磷菌的解磷机理，科研人员将磷矿粉制成培养液，培养从土壤中分离出的2种解磷菌（M-3-01、B3-5-6），测定培养液的上清液pH及其中的速效磷含量，结果如图，下列叙述正确的是（       ）

A．2种解磷菌是用只含磷矿粉的培养基分离出来的

B．由图可知，168h以内M-3-01解磷能力较强

C．B3-5-6转化无效磷的能力与培养溶液pH显著相关

D．据图推测B3-5-6可能借助分泌酸性物质溶解磷矿粉

10 . 三糖铁培养基（TSI）含有牛肉膏、蛋白胨、糖类（乳糖、蔗糖和葡萄糖的比例为10：10：1）、酚红（在酸性条件下呈黄色、碱性条件下呈红色）等成分。TSI琼脂试验法通过观察肠杆菌科细菌对三种糖的分解产生酸（少量的酸能被空气缓慢氧化）量的多少来鉴别其种类。操作过程是：用接种针挑取待测菌落后，刺入斜面TSI内，后缓慢抽出接种针，在斜面上进行“之”字划线。下列分析错误的是（       ）

A．牛肉膏可为细菌提供氮源和维生素等

B．穿刺和划线的过程需严格控制杂菌污染

C．若培养基中底层与斜面均呈黄色，推测细菌只能分解乳糖

D．若底层呈黄色、斜面先呈黄色后变红，推测细菌可能只分解葡萄糖