1 . 灰霉病是由灰葡萄孢（一种真菌）引起的农作物病害。为了绿色、高效地防治灰霉病，研究人员从灰霉病多发的大棚土壤中取样、分离出多种单菌落并进行扩大培养，随后将各组微生物的无菌发酵滤液与未凝固的普通培养基混合后倒平板，冷却后在平板中央接种灰葡萄孢，通过比较灰葡萄孢菌丝生长情况，从而筛选出高效的灰葡萄孢拮抗菌。下列叙述，错误的是（　　）

A．在灰霉病多发的大棚土壤取样，比普通土壤更有可能获得灰葡萄孢拮抗菌

B．取无菌发酵滤液的目的是用拮抗菌的代谢产物对灰葡萄孢产生抑制作用

C．为筛选出高效拮抗菌，只需在普通培养基接种等量灰葡萄孢作为对照

D．灰葡萄孢菌丝生长最缓慢、稀疏的组别对应的微生物即为最高效拮抗菌

4 . γ-氨基丁酸（GABA）在疾病治疗方面具有重要价值。微生物生产 GABA安全性高、绿色环保、周期短、成本低，但其产量受到多种因素制约。为提高GABA产量，科研人员采取了多种策略。回答下列问题：
(1)基因1控制酶1合成，催化谷氨酸（Glu）脱羧生成 GABA．基因2控制酶2的合成，酶 2催化 GABA生成琥珀酸半醛。基因3 控制转运蛋白1合成，转运蛋白1将 Glu转运到胞内，将GABA 转运到胞外。基因4控制转运蛋白2合成，转运蛋白2将胞外的GABA 转运至胞内。因此，可采取的策略是上调基因_____的表达水平，敲除基因_____。
(2)野生型菌种内源性酶1的活力较低，外源基因SNO1（675bp）和SNZ1（894bp）的表达产物能提高酶1的活性。科研人员拟利用原始质粒 A 构建重组质粒 B，利用重组质粒 B构建重组质粒C（如图），并在大肠杆菌中表达。

①PCR扩增前，可从_____中获知基因1、SNO1和SNZ1的碱基序列，然后设计含相应酶切位点的引物。扩增基因1时的引物应含_____和_____酶切位点。
②目的基因与载体连接后，将重组质粒导入大肠杆菌，将大肠杆菌涂布在含_____的平板上培养，挑选菌落提取质粒。通过对质粒进行双酶切和_____初步检验重组质粒构建是否成功，结果如图。泳道4是重组质粒C被_____和_____双酶切的结果。重组质粒B的酶切产物位于泳道_____，重组质粒C的酶切产物位于泳道4和_____。

③利用转基因大肠杆菌进行发酵，结果发现，与导入重组质粒 B的大肠杆菌相比，导入重组质粒C的大肠杆菌生产GABA的产量低，可能原因是_____基因的表达需消耗较多的物质与能量，不利于 GABA的合成。
(3)酶1在低pH值下发挥作用，而大多数微生物的最适生长条件pH偏中性，因此在发酵中可采取的策略是_____。

5 . PET是一种聚酯类塑料，全球每分钟生产约100万个PET塑料瓶。科学家从能够利用PET作为碳源的细菌中分离出了一种能降解PET的解聚酶。PET在70℃时才能完全变为液态，便于降解，但PET解聚酶不耐高温。为此，科研人员借助定向进化策略，提高PET解聚酶耐受高温的能力。该策略经历多轮定向进化（每一轮均在上一轮筛选出的目标菌株上开展），其涉及的信息如表所示。

每一轮的基本流程	定向进化（轮次）
	第一轮	第二轮	第三轮	第四轮	第五轮	第六轮
①基因突变和转化	将突变后的PET解聚酶基因导入大肠杆菌
②分离纯化和鉴定的菌株	5种	13种	4种	3种	5种	9种
③提取出的PET解聚酶预保温和酶活测定条件	1h/55℃	1h/60℃	1h/65℃	1h/70℃	1h/80℃	7h/70℃
④选出的PET解聚酶中变化的位点数	2个	1个	2个	3个	3个	5个

(1)研究人员从土壤样品中分离能产生PET解聚酶的细菌时，所使用的培养基成分应包括____________（编号选填）。
①（NH₄）₂SO₄   ②淀粉   ③PET   ④无机盐
(2)据所学知识判断，分离PET解聚酶的细菌所使用的培养基类型属于____________．（编号选填）
①天然培养基   ②合成培养基   ③液体培养基
④通用培养基   ⑤固体培养基   ⑥选择培养基
(3)表中流程②宜选用的接种方法为_____________（平板划线/稀释涂布），其目的是_______。
A.对大肠杆菌进行计数                    
B．扩大大肠杆菌种群数量
C．便于分离提取PET解聚酶             
D．将导入不同突变基因的大肠杆菌分离开
(4)本研究采用的定向进化策略，相比自然界的进化过程，区别是_______。

A．发生基因突变	B．实现个体进化
C．加快进化速度	D．模拟自然选择

(5)据题干及所学知识分析，研究人员在第6轮中设置70℃且长时间保温（7小时）的目的是______________。
(6)据题干信息判断，获取耐高温PET解聚酶的过程涉及_____。

A．基因工程

B．细胞工程

C．发酵工程

D．蛋白质工程

天然PET解聚酶基因（792bp）部分编码链序列以及用于表达载体构建的质粒结构如下图所示：
5’ATGCAGACTAACCCCTATGCTCGCGGG………GATTTTCGCACTGCTAACTGCAGC3'

(7)已知天然PET解聚酶基因不含合适的酶切位点，但可借助PCR解决该问题。据图信息判断，为了便于表达载体的构建，在设计PET解聚酶基因PCR反应体系时，应选择引物_____________。（编号选填）
①5’TACATATGCAGACTAACCCCTATGCTCG3’
②5’TGCTCGAGATGCAGACTAACCCCTATGC3’
③5’TACATATGGCTGCAGTTAGCAGTG3’
④5’TGCTCGAGGCTGCAGTTAGCAGTG3’
(8)为鉴定表达载体构建是否正确，研究人员从目标菌株中提取质粒，并经XhoI和NdeI充分处理后进行凝胶电泳。根据下图结果判断，含目的基因的菌落是___________。

9 . 为了将某纳米抗体和绿色荧光蛋白基因融合表达，运用重组酶技术构建质粒，如图1所示。请回答下列问题：

   

(1)分别进行PCR扩增片段F1与片段F2时，配制的两个反应体系中不同的有______，扩增程序中最主要的不同是______。
(2)有关基因序列如图2．引物F2-F、F1-R应在下列选项中选用______。
   

A．ATGGTG------CAACCA

B．TGGTTG------CACCAT

C．GACGAG------CTGCAG

D．CTGCAG------CTCGTC’

(3)将PCR产物片段与线性质粒载体混合后，在重组酶作用下可形成环化质粒，直接用于转化细菌。这一过程与传统重组质粒构建过程相比，无需使用的酶主要有_______。
(4)转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选，下列叙述错误的有_______。

A．稀释涂布平板需控制每个平板30~300个菌落

B．抗性平板上未长出菌落的原因一般是培养基温度太高

C．抗性平板上常常会出现大量杂菌形成的菌落

D．抗性平板上长出的单菌落无需进一步划线纯化

(5)为了验证平板上菌落中的质粒是否符合设计，用不同菌落的质粒为模板，用引物F1-F和F2-R进行了PCR扩增，质粒P1~P4的扩增产物电泳结果如图3．根据图中结果判断，可以舍弃的质粒有______。

   

(6)对于PCR产物电泳结果符合预期的质粒，通常需进一步通过基因测序确认，原因是______。