1 . 植物内生菌是一定阶段或全部阶段生活于健康植物的组织和器官内部的真菌或细菌，普遍存在于高等植物中。
(1)放线菌也是一种常见的内生菌，能抑制病原菌的生长。研究人员利用两种不同类型的放线菌获得新型工程菌，过程如下：
   
收集上述两种菌丝体，加入________（填“纤维素酶”或“溶菌酶”）处理，分离原生质体，将两种原生质体悬液等量混合，加入适量促融剂处理一段时间。终止反应并洗涤后，取一定量混合液接种于________（填“固体”或“液体”）培养基中培养。根据菌落特征，选出性状稳定的融合菌株。
(2)某真菌的w基因可编码一种高效降解纤维素的酶，已知图中w基因转录方向为从左往右。为使放线菌产生该酶，以图中质粒为载体，进行转基因。
   

限制酶	BamH I	EcoR I	Mfe I	Kpn I	HindⅢ
识别序列和切割位点	G↓GATTC	G↓AATTC	C↓AATTG	GGTAC↓C	A↓AGCTT

①限制酶主要是从________中分离纯化出来的。应使用限制酶________切割图中质粒，使用限制酶________切割图中含w基因的DNA片段，以获得能正确表达w基因的重组质粒。
②与质粒中启动子结合的酶是________。启动子通常具有物种特异性，在质粒中插入w基因，其上游启动子应选择________启动子（选填“植物”、“真菌”、“放线菌”）。
③W基因转录的模板链是________。利用PCR技术对W基因进行扩增的原理是________，子链的延伸方向是________。
④研究人员欲对W基因的mRNA进行RT-PCR，已知其mRNA的序列为5'-UGAACGCUA…（中间序列）…GUCGACUCG-3'。为了便于将扩增后的基因和载体成功构建成重组质粒，用于PCR扩增的引物应为________。
A.5'-TGAACGCTA…        B.5'-CGAGTCGAC…
C.5'-GAATTCTGA…        D.5'-AAGCTTCGA…

2 . 工程菌的高密度发酵受到溶氧等多种因素的制约。透明颤菌血红蛋白（vgb）能从微氧环境中摄取氧，提高胞内有效氧浓度，从而促进低溶氧条件下细菌的生长繁殖。研究人员根据Genbank公布的vgb基因及其启动子的序列信息，人工合成目的基因（含vgb启动子Pvgb及vgb编码区DNA片段），插入克隆载体质粒pUC57得到质粒pUC57-vgb。从pUC57中回收vgb启动子及编码区片段，再插入表达载体pET28a，得到重组质粒pET-vgb。将重组质粒导入大肠杆菌即得到适合低氧发酵的工程菌。部分过程如下图1所示，回答下列问题：
   
注：M为指示分子大小的标准参照物；小于0.2kb的DNA分子条带未出现在图中
(1)启动子Pvgb受环境中溶氧调节，当溶氧跌至20%以下时，Pvgb激活，合成vgb，这种启动子称为______________。
(2)提取pUC57-vgb，通过PCR技术扩增目的基因。扩增时需在两种引物的_______（填5′或3′）端分别添加BamHI和HindIII识别序列。PCR反应体系中需加入Mg²⁺离子，目的是____________________________。
(3)将构建好的重组质粒导入大肠杆菌时，需要用Ca²⁺处理大肠杆菌细胞，使细胞处于______________的生理状态。
(4)将转化后的大肠杆菌接种在含卡那霉素的培养基上进行培养，随机挑取菌落（分别编号为1、2、3、4）培养并提取质粒，用BamHI和HindIII两种限制酶进行酶切，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳分离。电泳结果如图2所示。
①在凝胶中DNA分子的迁移速率与____________________________（列举两点）有关。
②含目的基因的重组质粒很可能是_______号菌落的质粒。
(5)为进一步验证低氧发酵的工程菌是否构建成功，将（4）中挑选的菌种接种到液体培养基中培养，同时培养_______菌种作对照。在摇床上_______（填“低速”或“高速”）震荡培养，一段时间后检测菌体密度。

4 . 花生是我国重要的经济作物之一，根系在生长过程中，会分泌苯甲酸、苯乙酮、丙三醇、苯甲醛等物质，这些物质会抑制青枯病原菌和其他植物的生长。由于土地限制等原因，同一土地多年连续种植现象十分普遍，这些物质产生的自毒作用越来越明显，造成花生产量下降。扬州大学已采用“采集根际土壤→选择培养→分离、纯化培养→菌种鉴定”途径筛选出将苯甲酸降解为无毒小分子（CO₂和H₂O等）的根际菌。回答下列相关问题：
(1)花生根系分泌的苯甲酸等物质属于其____________（填“初生”或“次生”）代谢物，合成该类物质的代谢的进行特点是___________________。
(2)为什么要从连作花生的土壤中寻找降解苯甲酸的根际菌？______________
(3)为确保能够分离得到苯甲酸分解微生物，常将土壤稀释液先进行选择培养，该培养基的碳源要求为________________，进行该步操作的目的是________________。
(4)分离、纯化培养时，可采用____________________方法接种，从物理形态角度考虑，该培养基属于___________培养基。
(5)获得的菌种可通过___________工程大量增殖，并作为微生物肥料施用于土壤。采用微生物降解、修复土壤技术的优点有____________________
(6)筛选得到的降解苯甲酸的根际菌并不能直接推广应用，还需考虑的原因有哪些？（答出1点即可）____________

5 . 聚羟基脂肪酸酯（PHA）是由嗜盐细菌合成的一种胞内聚酯，它具有类似于合成塑料的理化特性，废弃后易被生物降解，可用于制造无污染的“绿色塑料”。科学家从某咸水湖中寻找生产PHA的菌种，流程图如下。下列叙述正确的是（       ）

   

A．步骤②可用稀释涂布平板法接种到含合成塑料的选择培养基上

B．步骤③所用的培养基中营养物质浓度越高，对嗜盐菌的生长越有利

C．扩大培养所用的培养基应加入琼脂，放置摇床上培养，以便于挑取菌落获得纯化菌株

D．挑取菌落时，应取多个菌落并分别测定嗜盐菌的PHA含量

7 . 氢能是潜力巨大的可再生清洁能源。利用产气肠杆菌制氢具有条件温和、环保等优点。E.as菌是产氢率较高的菌种，为进一步提高其产氢率，科研人员开展了相关研究。回答下列问题。
(1)为获得 E.as菌纯培养物，可采用________法进行纯培养。在培养过程中，设置未接种的平板作为对照，这样做的目的是________。
(2)为确定 E.as菌产氢率的最适温度，某同学进行了相关实验，请简要写出实验思路。________
(3)E.as菌细胞中hycA基因表达会抑制产氢代谢，科研人员通过同源重组方式使hycA蛋白失活，获得了产氢率更高的工程菌E.as⁃A，其技术流程如图所示。
   
①过程I中可采用________法处理 E.as 菌，以促进DNA片段P的导入 。
②过程II中，同源重组导致 hycA蛋白失活，其机制是_______。依据基因工程原理，采取其他手段也可达到同样的失活效果，可采用的其他手段有_______（写出一项即可）。
③过程Ⅲ应将菌种接种到含有________的培养基上进行筛选，最终获得E.as-A工程菌。

8 . 近期在“科学号”考察船对南中国海科考中，中国科学家采集了某海域1146米深海冷泉附近沉积物样品，分离、鉴定得到新的微生物菌株——拟杆菌新菌株并进一步研究了其生物学特性。有关说法错误的是（　　）

   

A．培养基接入沉积物样品后，需要在低温厌氧培养一段时间才能获得含拟杆菌的培养物

B．在以纤维素为唯一碳源时可以得到纯种培养的拟杆菌新菌株

C．将采集的样品置于各种培养基中培养，仍有很多微生物不能被分离筛选出来，推测其原因可能是某些微生物只有利用深海冷泉中的特有物质才能生存

D．藻类细胞解体后难降解的多糖物质，通常会聚集形成碎屑沉降到深海底部，推测拟杆菌新菌株为异养生物，作为分解者起作用

9 . 将两种氨基酸营养缺陷型大肠杆菌（菌株a和b）进行如下图所示实验。下列叙述正确的是（　　）

   

A．实验中接种至培养基方法是平板划线法

B．基本培养基出现的少量菌落一定是单菌落

C．基本培养基中包含菌株a和b的生长因子

D．菌株a和b需要的生长因子有所不同

10 . 下列关于生物实验的叙述正确的是（       ）

A．施旺、施莱登运用不完全归纳法得出一切动植物都由细胞发育而来

B．果酒发酵过程中，每隔12h左右打开瓶盖，释放酵母菌发酵产生的CO2

C．拜尔的实验在黑暗中进行是为了排除光照对胚芽鞘尖端合成生长素的影响

D．分别用含有35S和32P的两种培养基培养细菌，再用上述细菌分别培养病毒，检测子代病毒的放射性可区分是DNA病毒还是RNA病毒