3 . 白地霉侵染是导致柑橘酸腐病的主要原因，实验证明桔梅奇酵母对白地霉具有生物防治能力。已知铁是真菌生长的必需元素，是胞内重要酶活性中心的组成部分。普切明酸是桔梅奇酵母产生的一种水溶性铁螯合剂，能快速在培养基中扩散并与其中的Fe³⁺形成稳定红色复合物。研究配制的含有不同浓度FeCl₃的培养基如下表所示。实验结果为桔梅奇酵母菌落周围出现红色抑菌圈，随FeCl₃浓度增大，抑菌圈红色加深但变窄，如下图所示。相关叙述正确的是（       ）

成分	MgSO4	NaH2PO4	蛋白胨	FeCl3溶液	水	琼脂
用量	5g	7g	15g	500mL	7g	20g

A．实验中使用的培养基pH呈弱碱性，其中琼脂不是营养物质

B．白地霉采用了平板划线法，桔梅奇酵母采用了涂布平板法

C．白地霉不能利用与普切明酸结合后的铁是出现红色抑菌圈的原因

D．补足Fe3+可以使桔梅奇酵母对白地霉的抑制效果逐渐减弱

4 . 某研究小组设计了一个利用作物秸秆生产燃料乙醇的小型实验。其主要步骤是：先将粉碎的作物秸秆堆放在底部有小孔的托盘中，喷水浸润、接种菌T，培养一段时间后，再用清水淋洗秸秆堆（清水淋洗时菌T不会流失），在装有淋洗液的瓶中接种酵母菌，进行乙醇发酵（酒精发酵）。实验流程如图所示。下列选项不正确的是（　　）

A．菌T可能产生分解纤维素的酶，能够高效催化纤维素分解

B．淋洗液中还需要加入氮源等营养成分，氮源的主要作用是合成一些氨基酸、核苷酸等含氮物质

C．可采用高压蒸汽灭菌法对培养基进行灭菌，在使用该方法时需要注意必须将冷空气充分排除再开始加压

D．将酵母菌接种到灭菌后的培养基中，拧紧瓶盖，置于适宜温度下培养、发酵。发酵过程中，要始终保持密封状态

5 . 贝氏不动杆菌（A菌）是一种非致病性细菌，可从环境中吸收DNA并整合到自身基因组中，此过程被称为基因水平转移（HGT）。科学家试图利用A菌的HGT能力检测结肠癌。
(1)对微生物的基因改造是基因工程中应用最广泛的，原因是____（答出两个即可）。通常用含蛋白胨的培养基培养A菌，蛋白胨能提供碳源、氮源等成分，其中氮源可用于合成____等物质（答出两种即可）。
(2)结肠癌常由KRAS基因中G12位点突变导致，科学家以其作为结肠癌检测点。
①如图1所示，将针对KRAS基因设计的表达载体导入结肠癌细胞，某种酶能从相同序列特定位点切断____键，修复过程中切口被重新连接，从而实现特定基因片段的替换，获得转基因癌细胞。

   

②为验证A菌具有吸收特定DNA片段的能力，依据①中的原理，构建图2所示的表达载体，其中Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ分别对应的序列为____、spec^R（壮观霉素抗性基因）、____。导入A菌中获得传感器A。将传感器A与转基因癌细胞裂解液混合，一段时间后，观察传感器A在不同培养基中的生长情况。若实验结果为____，则能证明传感器A发生特异性HGT。
(3)肿瘤细胞可将DNA释放到肠腔中，临床检测时需将细菌传感器定植于待测者结肠处，一段时间后对粪便中的细菌进行培养，观察生长情况。为实现上述目的，需改造A菌使其仅能降解正常的KRAS序列，并对图2所示表达载体进行进一步改造（如图3）。若患有结肠癌，则细菌能在含有____的培养基中形成菌落，原因是____。

   

6 . 研究人员对大肠杆菌的营养代谢途径进行改造，使改造后的大肠杆菌工程菌能表达甲酰胺酶与亚磷酸脱氢酶融合蛋白，该融合蛋白能分解甲酰胺产生氨作为氮源，分解亚磷酸盐成为磷酸盐作为磷源。下图为构建表达甲酰胺酶与亚磷酸脱氢酶融合蛋白的大肠杆菌的过程。回答下列问题：

(1)PCR体系①和PCR体系②必须分开进行，其原因是________。将PCR体系①的产物与体系②的产物混合后，继续进行下一次PCR反应。在该PCR反应体系中经过高温变性后，当温度下降到50℃左右时，能够互补配对的DNA链相互结合，理论上有________种结合的可能，其中能进行进一步延伸的有________种。有关基因序列如下，引物b、c应在下列选项中选用________。
for基因序列：5’ATGGTGAGCAAGGGC——GACGAGCTGTACAAG3’
ptx基因序列：5’CATGTCCAGCTGCAG——CCAAAACCACAACCA3’
A.ATGGTG——CAACCA                     B.TGGTTG——CACCAT
C.GACGAG——CTGCAG                     D.CTGCAG——CTCGTC
(2)用限制酶_______切割质粒PGEX，再将酶切得到的融合基因for-ptx与质粒相连，构建pGEX—for—ptx重组质粒。转化大肠杆菌DH 5α后，可在添加______的培养基中，挑选DH5α转化阳性的重组菌株。
(3)从重组大肠杆菌DH 5α中提取质粒，用EcoRⅠ处理一定时间后进行电泳鉴定。得到图2所示电泳图谱。经测序后发现条带甲、乙序列和长度相同，但条带位置和形状却有差异，可能的原因是______。为便于观察与检测，电泳时需要利用不同的染料或指示剂。如制备琼脂糖凝胶时需加入荧光染料，上样时在加样孔中需要加入溴酚蓝染料，其中能和DNA分子特异性结合的是______。溴酚蓝染料的作用是______。

(4)将提取到的重组质粒导入大肠杆菌表达菌株BL21中，得到重组表达菌株BL21，收集菌体并加入到含有______的培养基中，继续培养得到重组大肠杆菌。此种方法培养大肠杆菌可以有效抑制杂菌的生长，其原理是______。

7 . 纳米抗体具备体积小、结构简单、稳定性显著等优点，而带荧光蛋白的纳米抗体可以帮助我们了解蛋白质在细胞或生物体内的定位和功能，荧光－抗体融合复合物可作为靶向生物分子进行疾病诊断和治疗等。为了将某纳米抗体和绿色荧光蛋白基因融合表达，运用重组酶技术构建质粒。重组酶技术指的是重组酶通过识别两个DNA片段上的特定相同序列，将不同DNA片段连接，从而实现DNA重组，如下图1所示。请回答下列问题：

(1)分别进行PCR扩增片段F₁与片段F₂时，配制的两个反应体系中不同的有____。
(2)有关基因序列如下图2.引物F₂－F、F₁－R应在下列选项中选用____。

(3)将PCR产物片段与线性质粒载体混合后，在重组酶作用下可形成环化质粒，之后转化大肠杆菌。这一过程与传统重组质粒构建过程相比，无需使用的酶主要有____。
(4)如图1所示，转化后的大肠杆菌需选择培养基进行筛选，下列叙述正确的有____。

A．是否产生氨苄青霉素可作为筛选大肠杆菌是否转化的依据

B．转化后的大肠杆菌需培养一段时间后接种至选择培养基进行筛选

C．将梯度稀释后的菌液用接种环在培养基表面进行划线获得单菌落

D．选择培养基上常常会出现大量杂菌形成的菌落

(5)为了验证平板上菌落中的质粒是否符合设计，用不同菌落的质粒为模板，用引物F₁－F和F₂－R进行了PCR扩增，质粒P₁~P₄的扩增产物电泳结果如图3.根据图中结果判断，可以舍弃的质粒有____。

(6)对于PCR产物电泳结果符合预期的质粒，通常需进一步通过基因碱基序列测定确认，原因是____ 。

8 . 抗癌药紫杉醇是从红豆杉树皮中提取的生物活性物质，由于红豆杉生长缓慢，易发生立枯病、茎腐病等病害，使紫杉醇的提取受到极大限制。科研人员利用组培技术提高了紫杉醇的产量，生产流程如下：

   

(1)外植体常选取红豆杉的茎尖，其优点有______。
所培养的细胞系不直接来自外植体而是来自愈伤组织，依据是______。
(2)紫杉醇能否实现工业化生产，关键是选择高产细胞系，研究发现，继代培养的细胞保持愈伤组织特性，既能实现高产又能保持生产特性的稳定性，为达到这一目的，关键是培养基的配制需满足：①__________________，②适合原种生长，防止细胞因培养条件改变发生____________，造成细胞系衰退。
(3)为选育高产细胞系，某研究小组用南方红豆杉不同外植体进行悬浮培养实验，结果如下图：

   

液体悬浮培养时接种量不能过高，否则可能引起培养体系中的____________不足，造成细胞生长缓慢。实验表明，液体培养条件下，应该选择____________来源的红豆杉细胞系，继代培养到第____________代提取紫杉醇，可获得最高产量。
(4)紫杉醇是红豆杉对环境的一种适应产物，试验表明，优化细胞生长环境，虽然提高了细胞生长速率，却导致紫杉醇含量降低。研究小组发现植物体内普遍存在内生真菌，它们也可产生紫杉醇，这一发现开辟了用微生物发酵技术生产紫杉醇的新途径，弥补了植物组培技术的不足。请你帮助该小组完成下列实验：
I.完成菌株的分离与纯化：
取红豆杉的老树皮，____________后，削去表层，从内部切取小块，斜插入半固体培养基中，28℃培养3~7d，挑取向培养基基质生长的菌丝体于固体培养基中，纯化2~3次。培养时，通常会添加马铃薯、蔗糖和一定浓度的青霉素，其目的是________________________。
II.菌株的鉴定
①形态学鉴定：将纯化的内生菌种进行发酵培养，通过液相色谱法检测发酵产物，筛选______真菌，再将分离的菌株置于固体培养基上，经培养后观察菌落形态特征。
②分子生物学鉴定：提取菌株基因组DNA作为______，扩增ITS序列（存在于真核生物中的一段rDNA转录间隔区），被广泛应用于真菌分类、鉴定，通过______检测并回收扩增产物，将纯化后的产物进行______，与基因数据库比对分析。
III.发酵培养与产品鉴定
内生真菌脱离植株后，由于生活环境改变，代谢水平受到影响，因此培养基的选择尤为重要。通过查阅资料推测通过添加______等物质能使紫杉醇产量提高。

9 . 研究显示，结肠癌等多种恶性肿瘤细胞会表达hCGβ蛋白，这与肿瘤的发生及转移可能有一定关系，通过各种生物反应器研发抗hCGβ蛋白已成为近年来肿瘤治疗领域热点问题。某制备抗hCGβ疫苗的流程如图1所示，其中启动子有物种特异性。

注：序列甲（320bp）指导合成的信号肽，能指引翻译后的多肽进入内质网腔；AXO1为甲醇诱导型的真核启动子，有甲醇存在的环境下才会启动表达。
回答下列问题：
(1)构建重组载体。图1中获取抗β基因的方法属于______，将抗β基因与甲序列一起构建形成融合基因，并与线性质粒连接。
(2)大肠杆菌转化。过程Ⅱ将环化质粒导入受体细胞，然后涂布于含氨苄青霉素的平板，在恒温培养箱中______培养，以利于获得单菌落，筛选分离出含抗β基因的大肠杆菌。
(3)鉴定融合基因。为鉴定抗β基因与甲序列是否融合成功，提取大肠杆菌的______作为模板，设计相应引物对融合基因进行PCR并电泳。在PCR过程中，每一个循环均包括变性、______三个阶段。为使扩增产物能被限制酶用于后续实验，应在引物5′端添加______，电泳时将样品与______混合后加入加样孔。凝胶中加样孔的一端朝向电泳槽的______（正极/负极）。电泳后得到图2所示结果，根据______，可推测PCR产物的长度，因此可判断______号泳道的样品符合要求。

(4)导入酵母菌。过程Ⅳ—Ⅴ中，将处理后的酵母菌接种于培养基中，该培养基不需要添加的成分有______（A．组氨酸   B．甲醇   C．无机盐   D．琼脂），此培养基上形成的母菌菌落即为目的菌株，此步骤不能通过培养基中添加氨苄青霉素作为筛选条件获得目标菌株的原因是______（答出两点）。
(5)基因表达检测。将酵母菌接种后于______上振荡培养，将培养物离心后分成细胞和培养液两部分，将细胞用缓冲液重新悬浮，并______处理后，再次离心取上清液。用hCGβ蛋白对上清液和之前获得的培养液通过______技术进行检测，若两组均呈阳性，则说明基因在酵母菌中______。
(6)发酵罐生产。为了解发酵罐中酵母菌数量，取5g皮渣加入45mL无菌水中，按照此法，梯度稀释至104倍。取0.1mL稀释液涂布计数，三个平板中菌落数分别为56、62和56，则此时每克皮渣酵母菌数量是______个。
(7)蛋白活性检测。已知DNS在90℃以上可与还原糖发生显色反应，将β蛋白与淀粉酶制成β-酶复合体，β-酶复合体蛋白与抗β蛋白结合后会遮盖复合体空间构象，使酶无法正常执行功能。向离心管加抗β蛋白、β-酶复合体反应10min，再加入淀粉反应10min，立刻沸水浴处理2min，此时沸水浴的目的是______。随后加入DNS并沸水浴处理10min，通过测定反应液的颜色变化，推测抗β蛋白的活性。颜色反应越深，可以反映抗β蛋白的活性越______。β-酶复合体需要在低温下保存，原因是______。