1 . 结核病是由结核杆菌引起的人畜共患病。结核杆菌通常以气溶胶形式传播，气溶胶颗粒被肺泡吞噬细胞吞噬，吞噬细胞破裂导致结核杆菌在机体内进一步传播。羊痒病是由正常细胞的非致病性朊蛋白异构化为痒病朊蛋白所致。为研制既能抗结核病又能抗羊痒病的双抗羊，科学家进行了如下操作。
(1)小鼠SP110基因是目前发现的具有抗结核杆菌感染功能的基因。研究人员为了验证SP110基因的功能，同时也为了验证山羊吞噬细胞特异性启动子MSR可以启动SP110基因在吞噬细胞内的表达，将MRS启动子与小鼠SP110基因形成融合基因，设计了下表所示的三组实验。

组别	主要操作	培养细胞后，使之破裂
对照组1	空质粒导入山羊肺泡吞噬细胞，接种适量结核杆菌	细胞培养72小时后，加入③_____，使吞噬细胞破裂，释放结核杆菌
对照组2	含有能广泛表达SP110基因的山羊肺泡吞噬细胞，①_____
实验组	②_____，接种等量的结核杆菌

取三组实验等量的细胞裂解液，用_____法培养，结果如下图1所示。由图可知小鼠SP110基因可用于双抗羊的研制，依据的实验现象是_____。

(2)非致病性朊蛋白是由山羊13号染色体上的PRNP基因的第三外显子控制合成的，PRNP基因的结构如图2．研究人员用新型基因敲除技术对体外培养的山羊成纤维细胞PRNP基因的外显子3序列实施定点敲除。请根据上述信息，设计一个检测敲除是否成功的思路：提取山羊成纤维细胞的DNA，根据_____设计引物进行PCR，并用_____作用于PCR产物后进行凝胶电泳，若仅获得一条电泳条带，说明定点敲除成功。

(3)用TALEN敲除载体与供体DNA表达载体（图4）共同转化体外培养的幼羊成纤维细胞，可将融合基因定点敲入PRNP基因的外显子3部位，原理如图3．请指出图4中数字1和2的分别代表的结构：1．_____、2．_____。经用_____法检测，山羊成纤维细胞中非致病性朊蛋白基因和SP110基因的表达情况是_____（填“两者均增加”或“两者均减少或不表达”或“前者减少、后者增加”或“前者增加、后者减少”）。

(4)欲用上述细胞获得双抗羊，需要用到的技术有_____（至少写出两项）。

2 . 重组质粒pMM085常用来生产工程疫苗，但因含氯霉素抗性基因cat，有增加环境中抗药基因的风险。pKD46是一种热敏感型工具质粒，只能在低于37°C的温度条件下稳定存在，它携带的Red基因在阿拉伯糖的诱导下表达Red重组蛋白，通过体内同源重组进行靶向基因敲除，原理如图1所示。asd基因编码细菌二氨基庚二酸（DAP）合成途径的关键酶，DAP是大肠杆菌细胞壁的主要成分，当asd基因缺失时，将导致菌株生长对DAP的依赖性。研究人员将质粒pMM085和pKD46导入asd缺失型大肠杆菌中，通过Red同源重组，将pMM085中的cat基因替换为asd基因，构建无抗性菌苗株，如图2所示。

(1)据图1分析，与传统转基因技术相比，Red体内同源重组具有的特点是：______。
(2)无抗药性菌苗的构建过程中（图2），①中应先用______处理，使asd基因缺陷型大肠杆菌处于感受态，然后将pMM085和pKD46转入大肠杆菌，经______诱导后，电击导入asd基因，获得重组质粒。
(3)将②中获得的菌液采用______方法接种到LB培养基上。
(4)挑取步骤③中获得的10个单菌落细胞进行PCR鉴定，得到电泳图谱（图3），电泳结果说明______。科研人员在上述实验基础上重新提取③中质粒再转化宿主菌，经选择性培养基筛选后获得仅含重组质粒的单菌落，请简要写出筛选的思路______。

3 . 毕赤酵母以甲醇作为唯一碳源时需要大量表达醇氧化酶（AOX1），AOX1基因的长度为2200bp。科研人员将蜂毒肽（MEL）与石斑鱼c型溶菌酶（Ec-cLYZ）基因插入pPICZαA质粒上构建重组表达质粒，导入毕赤酵母以获得高效低毒的广谱抑菌融合蛋白，实验的主要流程如下，请回答：

注：重组质粒1是人工合成的包含MEL和Ec-cLYZ融合基因
(1)斜带石斑鱼c型溶菌酶属于免疫系统的_______。相对于原核表达系统，毕赤酵母表达系统翻译出的蛋白可以经过_______加工修饰，表达的蛋白具有天然生物学活性。
(2)为获得MEL和Ec-cLYZ融合基因，同时两端带有pPICZαA的同源序列，过程①PCR反应体系中加入的模板是_______，引物应该选择以下_______。
A.5’-GAAACTGAAGCTCCCGAATTCGGTATTGGTGGT-3’
B.5’-CATCATCATCATCCCCGTCGACTTGATGCTGCAAGC-3’
C.5’-GGGGATGATGATGATGGAATTCTTGATGCTGCAAGC-3’
D.5’-GGGAGCTTCAGTTTCGTCGACGGTATTGGTGGT-3’
(3)过程②将PCR产物片段与线性化的pPICZαA混合后，在重组酶的作用下可形成环化质粒，这一过程与传统构建重组质粒相比不需要_______酶。
(4)为了验证构建是否成功，利用限制性内切酶EcoRI和SalI对提取出的重组质粒2进行双酶切，利用琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示分别得到大小约为_______（限制酶识别序列不计）的片段。过程③将重组质粒2导入大肠杆菌的目的是_______。
(5)过程⑤培养毕赤酵母时加入_______作为唯一碳源，目的是_______。
(6)目的基因与宿主基因组染色体的交换方式包括单交换和双交换。含有目的基因的载体插入宿主染色体的AOX1基因的上游或下游，不影响AOX1基因的正常表达，属于单交换；当发生基因取代时，含目的基因的载体与宿主染色体中AOX1基因区域发生交换，宿主AOX1基因编码区域被全部取代，属于双交换。以AOX1基因两端序列为依据设计引物，对三株重组酵母（编号1、2、3）进行菌液PCR、电泳后得到下图，根据结果推断目的基因与宿主基因组染色体发生单交换的酵母菌株有_______。

4 . 研究人员从金环蛇毒液中分离得到一种新型抗菌肽 CBF，其抗菌活性强、安全性好，同时具有抗炎作用，是抗生素的潜在替代品。
(1)运用基因工程技术，大规模生产抗菌肽，首先要从采集的麦秸秆垛底层土样分离枯草芽孢杆菌。制备的土壤悬液可采用____法分离纯化枯草芽孢杆菌。
(2)选用枯草芽孢杆菌为受体菌，通过转化法将构建好的基因表达载体导入枯草芽孢杆菌。目的基因在受体菌中能表达，但在对抗菌肽 CBF 功能进行检测时发现其功能异常，推测可能的原因是____（答一点即可），请你试提出一个相应的解决方案____。
(3)由于抗菌肽的抗菌特性使得它们对宿主菌具有潜在的致命毒性，影响抗菌肽的产量。利用SUMO融合技术（原理如图1：SUMO-CBF融合基因可以编码融合蛋白）在枯草芽孢杆菌中重组表达并制备具有活性的重组抗菌肽CBF可以减弱其对宿主菌的毒性。

SUMO-CBF融合基因可以拼接成功的理论基础是____（答两点即可）。
(4)为探究重组抗菌肽CBF-化学合成抗菌肽CBF联合抗菌机理，科学家利用透射电镜观察了各组金黄色葡萄球菌细胞内的超微结构，结果如图2。请据图回答问题。

结果显示：
（a）未加抗菌剂：细菌菌体较小，其细胞质分布均匀；
（b）化学合成抗菌肽CBF处理：细胞壁和细胞膜等结构不光滑，略显粗糙；
（c）重组抗菌肽CBF处理：细胞质出现较明显的固缩及空泡化现象；
（d）重组抗菌肽 CBF-化学合成抗菌肽 CBF联合处理：细胞壁及细胞膜等结构发生破裂，细胞质出现了严重的固缩及空泡化现象。
①设置 a组的目的是____。
②由此推测与c组比较，d组使金黄色葡萄球菌细胞质出现严重固缩及空泡化现象的机理是____。

5 . 在某地的农业生产中，研究人员发现了一种广泛使用的除草剂在土壤中不易被降解，且长期使用会导致土壤被污染。为修复被该除草剂污染的土壤，可按下图程序选育能降解该除草剂的细菌（已知该除草剂是一种含氮有机物，在水中溶解度低，含一定量该除草剂的培养基不透明）。下列相关叙述正确的是（       ）

A．只有长期使用该除草剂的土壤中才含有能降解该除草剂的细菌

B．筛选能降解该除草剂的细菌的培养基中该除草剂是唯一的氮源

C．图中操作Ⅰ的接种方法为平板划线法，该方法可用于细菌计数

D．经过一段时间的培养，培养皿中应该只存在有透明圈的菌落

6 . 聚羟基脂肪酸酯（PHA）是由嗜盐细菌合成的一种胞内聚酯，它具有类似于合成塑料的理化特性，废弃后易被生物降解，可用于制造无污染的“绿色塑料”。科学家从某咸水湖中寻找生产PHA的菌种，流程图如下。下列叙述正确的是（       ）

   

A．步骤②可用稀释涂布平板法接种到含合成塑料的选择培养基上

B．步骤③所用的培养基中营养物质浓度越高，对嗜盐菌的生长越有利

C．扩大培养所用的培养基应加入琼脂，放置摇床上培养，以便于挑取菌落获得纯化菌株

D．挑取菌落时，应取多个菌落并分别测定嗜盐菌的PHA含量

7 . 金属硫蛋白（MT）是一类广泛存在于动植物中具有金属结合能力的蛋白质，决定该蛋白质合成的基因结构如图1所示，其中A链为编码链、B链为模板链。科研人员利用图2所示质粒构建枣树的MT基因重组DNA分子并导入大肠杆菌细胞，获得对重金属镉（Cd）具有吸附能力和耐受能力的MT工程菌。回答下列问题：
      
（注：XhoI、KpnI、PstI为不同限制酶的识别位点：LacZ基因编码产生的β-半乳糖苷酶可以催化无色物质X-gal产生蓝色物质使菌落呈现蓝色，否则菌落为白色：amp基因为氨苄青霉素抗性基因。）
(1)获取目的基因提取枣树细胞的______，经逆转录获得cDNA：为了使PCR扩增后的产物按照正确的方向与已被酶切的载体连接，克隆MT基因时应选择的引物组合是______，并在其______（填“5'或3' ”）末端分别添加限制酶______的识别序列。
(2)构建重组DNA分子启动子是______识别并结合的部位：基因工程中构建用于原核生物的表达载体时，常用的启动子不包括以下哪一项？______（A、噬菌体基因启动子B、乳酸菌基因启动子C、大肠杆菌基因启动子D、枣树MT基因启动子）
(3)导入、筛选和鉴定MT工程菌。
①将得到的混合物导入到用______处理的大肠杆菌完成______实验
②将菌液稀释并涂布在含X-gal和氨苄青霉素的培养基上进行培养后，随机挑取______的单菌落可获得MT工程菌。
③欲进一步对MT工程菌进行鉴定，可将挑取出的MT工程菌与______分别接种至含______的LB液体培养基中，置于恒温培养箱中培养，适宜时间后检测菌种数量
(4)扩大菌种将MT工程菌接种至发酵罐内进行扩增，培养过程中可定期取样并使用细菌计数板对______（填“菌体”或“菌落”）进行直接计数，以评估增殖情况。发酵结束后，采用______等方法获得所需的发酵产品。

8 . 酵母菌絮凝是指菌体细胞间通过细胞壁相互粘附、聚集成团的现象。适当提高酵母的絮凝能力，有助于发酵后细胞和产物的分离，节约生产成本。科研人员为研究R基因对酵母菌絮凝性能的影响，用基因工程技术获得了R基因被敲除的酵母菌菌株，主要步骤如图1（G418为一种氨基糖苷类抗生素）。据图回答：

   

(1)过程①，引物2和引物4分别添加了MluⅠ的识别序列，则引物1和引物3的5'端分别添加_____的识别序列，PCR获取R基因左右两端的N和C片段过程中，除图中条件外，还需提供_____等条件（至少写三个）。
(2)利用含_____的培养基筛选出重组酵母，再挑取单菌落进行PCR扩增，验证酵母细胞R基因是否被敲除，则扩增时选择引物组合是_____。
(3)科研人员继续将野生酵母菌和R基因敲除酵母菌的菌液接种到装有麦芽汁的锥形瓶中，一定条件下静置发酵7天，测定酒精发酵能力和絮凝能力，结果如下表。

指标种类	酒精发酵能力	絮凝能力
野生酵母菌	4．5%	63．1%
R基因敲除酵母菌	4．5%	83．1%

①酒精发酵期间，每个锥形瓶应注意保持_____条件和定期排气。
②实验结果表明，R基因敲除酵母菌是否符合生产需求？请说出你的判断依据。_____。
(4)科研人员又将不同浓度梯度的R基因敲除酵母菌菌液和野生酵母菌菌液点样于含30g/mL钙荧光白（细胞壁抑制剂，破坏细胞壁的正常组装）的YPD培养基上，结果如图2．推测R基因敲除酵母菌絮凝能力变化的原因是_____。

   

9 . 细菌X合成的tcel蛋白和tcil蛋白使其在与其他细菌的竞争中占优势，其中tcel蛋白是一种有毒性的分泌蛋白。研究人员利用野生型细菌X及其不同突变体进行了实验：在固体培养基表面放置一张能隔离细菌的滤膜，将一种菌（下层菌）滴加在滤膜上后再放置第二张滤膜，滴加等量的另一种菌（上层菌），共同培养后，对上、下层菌计数得到如图结果。下列分析正确的是（       ）

A．实验中的培养皿、固体培养基和滤膜均需要进行灭菌处理

B．对上、下层菌计数时应采用稀释涂布平板法而不能用显微镜直接计数

C．由甲、乙、丙三组结果可推测 tcil蛋白能够中和tcel蛋白的毒性

D．野生型细菌X在与tcel-tcil双突变体和tcel突变体的竞争中均占优势

10 . 固定化酶是指在一定的空间范围内起催化作用，并能反复和连续使用的酶。固定化酶用于生产前，需要获得酶的有关数据。如图：曲线①表示相对酶活性，即某种酶在各种温度下酶活性相对最高酶活性的百分比：曲线②表示残余酶活性，即将该种酶在不同温度下保温足够时间，再在酶活性最高的温度下测得的酶活性。下列分析正确的是（       ）

A．曲线①是在其它条件适宜，不同温度时测得的数据

B．由曲线①可知，该酶在温度为80℃时的催化效率最高

C．曲线②是将该种酶在不同温度下保温足够时间，温度为80℃时测得的数据

D．若该种酶固定化后用于生产，使用的最佳温度是80℃