1 . PET是一种聚酯类塑料，全球每分钟生产约100万个PET塑料瓶。科学家从能够利用PET作为碳源的细菌中分离出了一种能降解PET的解聚酶。PET在70℃时才能完全变为液态，便于降解，但PET解聚酶不耐高温。为此，科研人员借助定向进化策略，提高PET解聚酶耐受高温的能力。该策略经历多轮定向进化（每一轮均在上一轮筛选出的目标菌株上开展），其涉及的信息如表所示。

每一轮的基本流程	定向进化（轮次）
	第一轮	第二轮	第三轮	第四轮	第五轮	第六轮
①基因突变和转化	将突变后的PET解聚酶基因导入大肠杆菌
②分离纯化和鉴定的菌株	5种	13种	4种	3种	5种	9种
③提取出的PET解聚酶预保温和酶活测定条件	1h/55℃	1h/60℃	1h/65℃	1h/70℃	1h/80℃	7h/70℃
④选出的PET解聚酶中变化的位点数	2个	1个	2个	3个	3个	5个

(1)研究人员从土壤样品中分离能产生PET解聚酶的细菌时，所使用的培养基成分应包括____________（编号选填）。
①（NH₄）₂SO₄   ②淀粉   ③PET   ④无机盐
(2)据所学知识判断，分离PET解聚酶的细菌所使用的培养基类型属于____________．（编号选填）
①天然培养基   ②合成培养基   ③液体培养基
④通用培养基   ⑤固体培养基   ⑥选择培养基
(3)表中流程②宜选用的接种方法为_____________（平板划线/稀释涂布），其目的是_______。
A.对大肠杆菌进行计数                    
B．扩大大肠杆菌种群数量
C．便于分离提取PET解聚酶             
D．将导入不同突变基因的大肠杆菌分离开
(4)本研究采用的定向进化策略，相比自然界的进化过程，区别是_______。

A．发生基因突变	B．实现个体进化
C．加快进化速度	D．模拟自然选择

(5)据题干及所学知识分析，研究人员在第6轮中设置70℃且长时间保温（7小时）的目的是______________。
(6)据题干信息判断，获取耐高温PET解聚酶的过程涉及_____。

A．基因工程

B．细胞工程

C．发酵工程

D．蛋白质工程

天然PET解聚酶基因（792bp）部分编码链序列以及用于表达载体构建的质粒结构如下图所示：
5’ATGCAGACTAACCCCTATGCTCGCGGG………GATTTTCGCACTGCTAACTGCAGC3'

(7)已知天然PET解聚酶基因不含合适的酶切位点，但可借助PCR解决该问题。据图信息判断，为了便于表达载体的构建，在设计PET解聚酶基因PCR反应体系时，应选择引物_____________。（编号选填）
①5’TACATATGCAGACTAACCCCTATGCTCG3’
②5’TGCTCGAGATGCAGACTAACCCCTATGC3’
③5’TACATATGGCTGCAGTTAGCAGTG3’
④5’TGCTCGAGGCTGCAGTTAGCAGTG3’
(8)为鉴定表达载体构建是否正确，研究人员从目标菌株中提取质粒，并经XhoI和NdeI充分处理后进行凝胶电泳。根据下图结果判断，含目的基因的菌落是___________。

2 . α-淀粉酶催化淀粉生成麦芽糖直至葡萄糖的反应，一些具有独特性能（如低温催化）的α-淀粉酶在食品、日用品等多个工业领域中具有重要用途。
(1)为了找到性能优异的α-淀粉酶，科研人员从世界各地的微生物中鉴别出多种不同结构和性能的α-淀粉酶，其活性部位的氨基酸序列比较如表1所示。表中数据可作为生物进化的______证据。

微生物名称	α-淀粉酶活性部位氨基酸序列	性能
黑曲霉	…DVVANH…GEV…NHD…	来自温带土壤，常温催化
假交替单胞菌	…DVVINH…GEA…NHD…	来自北极海底，低温催化
酵母菌	…DGVFGH…GYG…NHD…	来自温带海洋，常温催化
解淀粉芽孢杆菌	…DVVLNH…GIW…HFN…	来自热带土壤，高温催化

(2)为了比较不同来源淀粉酶的活性，科研人员设计了如下所示的实验。试在表格2中的①②③处填写相应的数值。

试剂（mL）	管号	1	2	3	4
蒸馏水		0.4	0.4	0.4	①____
缓冲液		0.5	0.5	0.5	0.5
淀粉溶液		2.0	2.0	2.0	2.0
假交替单胞菌提取液		0.1
酵母菌提取液			0.1
解淀粉芽孢杆菌提取液				②____	③____
总体积		3.0	3.0	3.0	3.0

(3)科研人员挑选表1中假交替单胞菌的α-淀粉酶基因Amy3与质粒pET-22b连接，并转入大肠杆菌中表达。根据图1所示信息，质粒应用限制酶____________切开。

(4)已知大肠杆菌不能分泌表达出的重组α-淀粉酶，因此分离纯化重组α-淀粉酶的第一步操作应是____________。在很多情况下，获得的纯酶还需要固定化，其目的是____________。
(5)欲测定重组α-淀粉酶的活性，检测实验结果可选用的试剂是____________。
(6)科研人员在调查上述重组α-淀粉酶的最适pH时，使用了三种化学成分不同的pH缓冲液（因为每种缓冲液只能维持有限的pH范围），实验结果如图2所示。试解释在pH为7.5和9.0时实验数据不吻合的原因是____________。