1 . 黑水虻是重要的资源昆虫，体内H基因编码的抗菌肽HI-3具有抗菌、抗癌和免疫调节作用。科研人员利用酵母菌生产抗菌肽HI-3，并避免基因污染。请回答下列问题：
(1)利用PCR技术扩增H基因，需根据H基因设计两种引物，引物的作用有____。

A．为Taq酶提供结合位点	B．决定扩增产物大小
C．决定反应的特异性	D．决定变性时间

(2)已知H基因编码链的编码区序列是：5'-CTCGAGATGCTGCAG………GGATCCTC-TAGA-3'，扩增H基因的编码区段时，结合到编码链上的引物序列是_____________（方向为5'→3'，写出5'端8个碱基序列）。获得H基因产物后需要进行凝胶电泳，将符合要求的条带______________以便提取纯化并进行测序。
(3)由于抗菌肽HI-3会损伤酵母细胞，组成型表达（持续表达）H基因的酵母菌最大种群数量偏低，限制了最终产量。科研人员通过构建诱导型启动子来降低抗菌肽HI-3对酵母菌的伤害。在酵母菌基因组DNA中插入P和S基因，使质粒上H基因的表达受红光控制。红光调控H基因表达的原理如图1所示。

   

P和S基因表达应为_______________（从“组成型表达”“红光诱导型表达”选填）。红光调控H基因表达的原理是S基因指导合成的S蛋白直接与启动子Jub结合，P基因表达的P蛋白在_____________，启动H基因的表达过程。
(4)发酵后菌体和产物分离是发酵工艺的基本环节。定位于细胞表面的F蛋白可使酵母细胞彼此结合，进而沉淀在发酵罐底部。科研人员引入蓝光激活系统如图2，在酵母菌基因组中插入了两个均能合成E蛋白的基因（E₁、E₂），使F基因的表达受到蓝光控制如图3。

   

图3中E₂基因持续性表达少量的E蛋白时，酵母细胞具有接受蓝光刺激的能力，E₁基因的作用是_____________。
(5)制药过程中需避免工程菌泄露到环境中引发基因污染。科研人员利用两种阻遏蛋白基因（T和L）和调控元件，使酵母细胞在红光和蓝光同时照射时才激活致死基因N的表达，进而诱导工程菌死亡，如图4。

   

若图中①选用的启动子为Jub，②处选用的启动子为CYC，则③④处结合的阻遏蛋白分别为______________。
(6)请结合上述分析，利用该工程菌发酵生产抗菌肽HI-3各阶段需控制的光照条件是：I菌种培养阶段_____________；Ⅱ菌种发酵阶段____________；II产物分离阶段_____________；IV安全处理阶段红光、蓝光同时照射。

2 . 植物内生菌是一定阶段或全部阶段生活于健康植物的组织和器官内部的真菌或细菌，普遍存在于高等植物中。
(1)放线菌也是一种常见的内生菌，能抑制病原菌的生长。研究人员利用两种不同类型的放线菌获得新型工程菌，过程如下：
   
收集上述两种菌丝体，加入________（填“纤维素酶”或“溶菌酶”）处理，分离原生质体，将两种原生质体悬液等量混合，加入适量促融剂处理一段时间。终止反应并洗涤后，取一定量混合液接种于________（填“固体”或“液体”）培养基中培养。根据菌落特征，选出性状稳定的融合菌株。
(2)某真菌的w基因可编码一种高效降解纤维素的酶，已知图中w基因转录方向为从左往右。为使放线菌产生该酶，以图中质粒为载体，进行转基因。
   

限制酶	BamH I	EcoR I	Mfe I	Kpn I	HindⅢ
识别序列和切割位点	G↓GATTC	G↓AATTC	C↓AATTG	GGTAC↓C	A↓AGCTT

①限制酶主要是从________中分离纯化出来的。应使用限制酶________切割图中质粒，使用限制酶________切割图中含w基因的DNA片段，以获得能正确表达w基因的重组质粒。
②与质粒中启动子结合的酶是________。启动子通常具有物种特异性，在质粒中插入w基因，其上游启动子应选择________启动子（选填“植物”、“真菌”、“放线菌”）。
③W基因转录的模板链是________。利用PCR技术对W基因进行扩增的原理是________，子链的延伸方向是________。
④研究人员欲对W基因的mRNA进行RT-PCR，已知其mRNA的序列为5'-UGAACGCUA…（中间序列）…GUCGACUCG-3'。为了便于将扩增后的基因和载体成功构建成重组质粒，用于PCR扩增的引物应为________。
A.5'-TGAACGCTA…        B.5'-CGAGTCGAC…
C.5'-GAATTCTGA…        D.5'-AAGCTTCGA…

3 . 工程菌的高密度发酵受到溶氧等多种因素的制约。透明颤菌血红蛋白（vgb）能从微氧环境中摄取氧，提高胞内有效氧浓度，从而促进低溶氧条件下细菌的生长繁殖。研究人员根据Genbank公布的vgb基因及其启动子的序列信息，人工合成目的基因（含vgb启动子Pvgb及vgb编码区DNA片段），插入克隆载体质粒pUC57得到质粒pUC57-vgb。从pUC57中回收vgb启动子及编码区片段，再插入表达载体pET28a，得到重组质粒pET-vgb。将重组质粒导入大肠杆菌即得到适合低氧发酵的工程菌。部分过程如下图1所示，回答下列问题：
   
注：M为指示分子大小的标准参照物；小于0.2kb的DNA分子条带未出现在图中
(1)启动子Pvgb受环境中溶氧调节，当溶氧跌至20%以下时，Pvgb激活，合成vgb，这种启动子称为______________。
(2)提取pUC57-vgb，通过PCR技术扩增目的基因。扩增时需在两种引物的_______（填5′或3′）端分别添加BamHI和HindIII识别序列。PCR反应体系中需加入Mg²⁺离子，目的是____________________________。
(3)将构建好的重组质粒导入大肠杆菌时，需要用Ca²⁺处理大肠杆菌细胞，使细胞处于______________的生理状态。
(4)将转化后的大肠杆菌接种在含卡那霉素的培养基上进行培养，随机挑取菌落（分别编号为1、2、3、4）培养并提取质粒，用BamHI和HindIII两种限制酶进行酶切，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳分离。电泳结果如图2所示。
①在凝胶中DNA分子的迁移速率与____________________________（列举两点）有关。
②含目的基因的重组质粒很可能是_______号菌落的质粒。
(5)为进一步验证低氧发酵的工程菌是否构建成功，将（4）中挑选的菌种接种到液体培养基中培养，同时培养_______菌种作对照。在摇床上_______（填“低速”或“高速”）震荡培养，一段时间后检测菌体密度。

5 . 家禽的谷物饲料中富含纤维素，但家禽消化道中缺少能降解纤维素的酶，降低了家禽对饲料的吸收与利用。乳酸杆菌是动物胃肠道中的优势有益菌之一，枯草芽孢杆菌可产生降解纤维素的一种酶，这种酶由W基因编码。研究人员将W基因转入乳酸杆菌，规模化生产后将其添加于饲料，以提高家禽的养殖效率。
(1)乳酸杆菌与家禽的种间关系属于____________，组成纤维素的单体是____________，枯草芽孢杆菌产生的纤维素降解酶是一种____________（选填“胞外”或“胞内”）酶。
(2)要在乳酸杆菌中表达W基因，需使用图1中的质粒为载体。图2为克隆得到的含W基因的DNA片段，W基因以乙链为转录模板链。

①启动子往往具有物种特异性，在图1质粒中插入W基因，其上游启动子应选择____________（填字母）。
A．枯草芽孢杆菌启动子             B．乳酸杆菌启动子             C．农杆菌启动子
②下表是几种限制酶的识别序列及其切割位点，图1、图2中标注了相关限制酶的酶切位点。

限制酶	EcoRI	BamHI	KpnI	MfeI	HindⅢ
识别序列及切割位点

为获得能正确表达W基因的重组质粒，应选用限制酶____________切割图1中的质粒，选用限制酶____________切割图2中含W基因的DNA片段。所得重组质粒转化乳酸杆菌后，使用含_____________的培养基筛选，以得到转入W基因的乳酸杆菌。
(3)为确定导入重组质粒的乳酸杆菌是否具有分解纤维素的能力，研究人员用液体培养基分别培养下表所示菌种。所得部分菌液接种于固体鉴定培养基上，另取部分菌液上清液测定酶活力，实验方案及测定结果如下表所示。

菌种	酶活性相对值
乳酸杆菌	未检出
X	未检出
导入了重组质粒的乳酸杆菌	0.96

①表中的X应为_____________。
②在配制固体鉴定培养基时，除加入无机盐、刚果红、维生素、氮源外，还需要添加_____________。导入了重组质粒的乳酸杆菌在此培养基上应出现_____________。

6 . 微生物接种史微生物培养中非常重要的技术环节。下图是关于接种的操作步骤示意图。请据图回答有关问题。

(1)图中接种工具的名称是_____________，步骤②中，灼烧后必须先将接种工具冷却的原因是_____________。
(2)步骤③中进行划线操作的目的是_____________，划线时不能划破嵌入培养基内的原因可能有_____________，并且需要在离酒精灯火焰10cm范围内操作的原因是_____________。
(3)分别用三个平板培养三种细菌（E.coli，S.albus，B.subtilis），然后在培养基上分别滴一滴一定浓度的青霉素溶液，经过一定时间培养后，可以观察到一圈清晰区，这是抑制细菌生长所致。测量清晰区的直径，数据如下：

细菌	不同浓度青霉素条件下清晰区直径（mm）
	5μg/mL	7.5μg/mL	10μg/mL	15μg/mL	20μg/mL
E.coli	7	10	16	16	16
S.albus	0	5	8	13	17
B.subtilis	5	7	9	14	19

该实验的目的是_____________。从表中数据可以看出，10μg/mL青霉素和20μg/mL青霉素在抑制E.coli和S.albus上的区别是_____________、_____________。
(4)利用选择培养基可以筛选微生物，制备培养基时，灭菌和调PH的先后顺序是_____________在利用高压蒸汽灭菌锅对培养基灭菌时，锅内水加热煮沸后，必须_____________，以保证灭菌温度达到121℃。

7 . 某学者利用“影印培养法”研究大肠杆菌抗链霉素性状产生的原因，先将原始菌种涂布在1号培养基上，培养出菌落后，将灭菌绒布在1号上印模，绒布沾上菌落并进行转印，使绒布上的菌落按照原位接种到2号和3号培养基上。待3号上长出菌落后，在2号上找到对应的菌落，然后接种到不含链霉素的4号培养液中，培养后再涂布到5号培养基上，并重复以上步骤。实验过程如图所示。下列相关叙述错误的是（       ）

A．大肠杆菌抗链霉素的性状是由基因突变引起的

B．大肠杆菌的抗链霉素突变是由链霉素诱导产生的

C．4号与8号培养液中，抗链霉素菌株的比例逐渐增大

D．在一定时间内4号培养液中大肠杆菌的数量逐渐增多

8 . 图A为固定化酵母细胞实验的部分操作，图B为固定化前后对某种酶活性的影响。有关说法正确的是（       ）

             A                                                                                                           B

A．图A中X溶液是生理盐水，有利于凝胶珠的形成

B．图A中注射器距离X溶液液面的远近对凝胶珠的形状无影响

C．固定化酶热稳定性有所提高，有利于其在较高温度下具有更高活性

D．固定化酶可重复利用节约成本，且不会改变其最佳催化效率

9 . 制作葡萄酒时，在部分发酵液中加入果胶酶处理一段时间后，得到如下表所示结果，相关叙述错误的是(　　)

A．果酒制作时一般将温度控制在18～25℃

B．葡萄酒的澄清度随果胶含量减少而下降

C．果胶酶在酸性条件下仍具有催化活性

D．Ⅰ组中还原糖含量高主要是因为有更多的多糖被分解

10 . 以下关于生物学实验和技术的叙述，正确的是（）
①检测生物组织中的还原糖       ②用高倍显微镜观察叶绿体       ③肺炎双球菌的体外转化④果酒和果醋的制作                 ⑤DNA的粗提取与鉴定             ⑥单克隆抗体的制备

A．①⑤均需使用酒精溶液	B．②⑥均可体现细胞膜流动性
C．③④均制备固体培养基	D．③⑥均需利用无菌操作技术