【推荐3】研究发现，TRIM59基因在肝癌细胞中存在异常表达，可用于原发性肝癌的早期诊断。TRIM59蛋白含有R、B、C和TM四个功能区，如图1所示；科研人员采用一定的技术手段，获得了TRIM59基因的cDNA，分别构建TRIM59基因过表达及TRIM59基因敲除质粒，分别转染肝癌细胞株后，过表达及敲减细胞株的增殖情况如图2所示。

图1   TRIM59蛋白质功能区                 图2   TRIM59对肝癌细胞增殖能力的影响

(1)图2的实验结果表明____。
(2)科研人员通过PCR扩增了图1中4种不同长度的蛋白质功能区组合片段所对应的TRIM59基因片段，并插入下图3所示的带FLAG标签序列（27bp）的载体中，与FLAG标签序列形成融合基因。FLAG是一种短肽，使融合蛋白能与含有FLAG抗体的介质结合，但不影响TRIM59蛋白功能区的功能。

图3

PCR扩增4种不同长度TRIM59基因片段需要的引物有____种；为了使目的基因正确插入，除∆R对应的TRIM59基因片段以外，在目的基因上游引物的5'端应插入____（“BamHI”或“EcoRI”）的识别序列，理由是____；可利用PCR技术验证融合基因是否构建成功，其实验思路是____。
(3)体外实验发现TRIM59蛋白和PPM1B蛋白有结合现象。为了研究两蛋白在细胞内是否结合，科研人员分别将FLAG-TRIM59（FL）质粒、FLAG-TRIM59（R+B）质粒、FLAG-TRIM59（R）质粒、FLAG-TRIM59（∆R）质粒与带有GFP标签的GFP-PPM1B质粒共同转染受体细胞，以单独转染GFP-PPM1B质粒的受体细胞作为对照。分别利用FLAG抗体和GFP抗体对①至⑤实验细胞裂解液中的蛋白质进行检测，结果如图4中胶片一、二所示。再利用GFP抗体对上述FLAG抗体免疫沉淀中的蛋白质进行检测，结果如胶片三所示。

图4

图中实验结果说明____。
(4)研究发现TRIM59蛋白的R功能区具有泛素化连接酶的活性，可介导泛素化途径降解PPM1B蛋白，PPM1B能够使某种蛋白去磷酸化进而抑制癌细胞的增殖和转移，据此可推测肝癌患者中TRIM59蛋白和PPM1B蛋白的量呈____相关。

【推荐1】肝再生磷酸酶-3 (PRL-3)在多种类型肿瘤的生长和转移进程中发挥着重要作用。为探究PRL-3在结直肠癌发生发展过程中的作用，科研人员做了相关研究。

(1)科研人员提取 Hela 细胞的总 RNA，经___________过程获得 cDNA。以 cDNA 为模板经 PCR 扩增出 PRL-3 基因。将质粒载体和 PRL-3 基因用 EcoR1、Xbal 两种酶进行切割后用___________酶处理，获得重组 PRL-3 质粒。此过程中进行双酶切的目的是___________。
(2)将重组 PRL-3 质粒转入结直肠癌细胞系 SW620 细胞中，同时将___________作为对照，不做任何处理的 SW620 细胞作为空白对照，培养相同时间后检测三组细胞中的 PRL-3 蛋白的含量。若实验结果为___________，说明重组 PRL-3 质粒在 SW620 细胞成功表达。
(3)实验发现实验组的增殖能力明显强于空白对照组。进一步通过流式细胞术检测细胞周期情况，结果如图 1。 说明 PRL-3 通过___________促进细胞增殖中。
(4)miRNA 是在真核生物中发现的一类内源性的具有调控功能的非编码 RNA， Dicer 是miRNA 产生过程中的关键酶。与正常组织相比，直肠癌组织内miRNA 的表达下降。为研究 PRL-3 与 miRNA 途径的相关性进行研究，结果如图 2。请阐述 PRL-3 在结直肠癌发生发展过程中的作用机理___________。

【推荐1】亚麻是一种油料经济作物，其种子中含有人体必需的不饱和脂肪酸-亚油酸和亚麻酸。两种不饱和脂肪酸在种子中的代谢途径如下图所示。

(1)脂肪酸是脂类物质，它们是构成细胞膜中______的重要组成物质。
(2)科学家期望通过基因工程手段进一步提高种子中亚麻酸的含量。将基因FAD2、FAD3导入亚麻中获得转基因植株，收获转基因植株种子，测定其相应脂肪酸含最，结果如下图1，该结果显示______，净含量变化值是与______相比获得的数据。

(3)研究发现出现上述结果的原因主要与外源FAD2基因的转入有关。为探究该影响机制，科研人员对FAD2基因的表达水平进行了研究，实验结果如下图2。进一步研究发现转基因植株中存在图3所示的调控FAD2基因表达的过程。催化①过程转录的酶是______；②过程由RDR6酶催化，①和②的不同是______。出现图1结果的原因是______。

(4)为验证RDR6酶是否参与了图1现象的发生，请选用以下植株，及FAD2基因表达载体进行实验，并写出预期结果。
植株：野生型拟南芥，RDR6突变体，FAD2突变体
实验设计思路______。
预期结果______。

【推荐2】三氯生是一种抑菌物质，可以替代抗生素用于基因工程中筛选含目的基因的受体细胞。2021年某科研团队通过先筛选出一种对三氯生抵抗性较强的重组质粒，再将可以受温度调控的基因插入该质粒上，构建了温度调控表达质粒。

(1)图中步骤a是基因工程四个步骤之一，则步骤a为______________。
(2)已知fabV基因（pa和pp代表从不同菌中获得）可以使大肠杆菌抵抗三氯生。在图中，fabV-pa基因和fabV-pp基因是_______（目的/标记）基因。
为获得一种增强大肠杆菌对三氯生的抵抗作用效果较好的重组质粒，将含有不同质粒的大肠杆菌分别接种到含三氯生或者不含三氯生的培养基中。培养一段时间后，结果如图。

(3)设置pF2组（无三氯生）和pF2组（含三氯生）的原因是____________

A．验证pF2质粒可以促进大肠杆菌生长

B．验证pF2质粒可以抑制大肠杆菌生长

C．验证三氯生对含pF2质粒的大肠杆菌生长无影响

D．验证三氯生可以抑制含pF2质粒的大肠杆菌生长

(4)结合图，说说哪种质粒会被用于构建温度调控表达，并说明理由。________________。
科学家对上述选出质粒进行改造，获得了图所示质粒。其中P₁和P₂是启动子，可以启动转录；C基因在低温下会抑制P₁；R基因在高温下会抑制P₂；T₁和T₂是终止子，可以终止转录。

(5)如果将lacZ基因和GFP基因插入图质粒中，使得最后表现为低温下只表达GFP蛋白，而高温下只表达lacZ蛋白。则以下说法正确的有________

A．GFP基因插在R基因和终止子T1之间

B．lacZ基因插在R基因和终止子T1之间

C．GFP基因插在启动子P2和终止子T2之间

D．lacZ基因插在启动子P2和终止子T2之间

(6)如果仅将GFP（绿色荧光蛋白）基因插入图质粒，构建成一个新的重组质粒。利用该重组质粒进行基因工程，受体细胞为大肠杆菌。那么，在筛选含有目的基因的受体细胞时，如何判断是否成功？（不考虑温度因素）____________________________________。

【推荐3】表皮生长因子受体（EGFR）是原癌基因表达的产物。EGFR 由胞外区、跨膜区、胞内区三部分组成， EGFR与其配体结合后能引起一系列基因活化，导致肿瘤细胞增殖。DNEGFR 基因是EGFR基因缺失了胞内区的突变基因，科研人员研究了DNEGFR基因表达和定位情况，流程如下图， 请回答：
   
(1)从人结肠癌组织中提取总RNA，经_________过程合成cDNA。根据人EGFR 前体cDNA的序列设计合成引物，扩增得到 DNEGFRcDNA，其表达产物因缺失胞内区而没有信号转导功能，但其能够与_________竞争结合配体，从而达到抑制肿瘤细胞增殖的作用。
(2)RT-PCR 过程所用引物如下，据上图可知，构建重组质粒时使用的两种限制酶是_________。研究人员将DNEGFR 和y融合在一起的目的是_________。
   
(3)本实验将EGFP 序列融合在 DNEGFR序列的下游而不是上游，原因是若将 EGFP 序列放在上游， ______________。
①DNEGFR基因表达的前体蛋白的信号肽段不能发挥定位作用
②会影响配体与胞外区的结合
③会影响 EGFP 基因的表达
④会影响质粒的复制
(4)向感受态细菌悬浮液中加入重组质粒混匀。扩大培养后取菌液涂布于卡那霉素筛选LB平板上，37℃正向放置0.5h，正向放置0.5h的目的是_________，然后倒置平皿37℃培养12~16h。挑选菌落分别扩增、鉴定，待鉴定正确后大量提取质粒。
(5)将重组质粒pEGFP-N1-DNEGFR包裹到主要由_________构成的脂质体内，与动物细胞发生融合，重组质粒最终发生转化。72h后再利用光谱激光扫描共聚焦显微镜观测结果见下图A，检测表明融合蛋白成功锚定于_________，细胞质存在少量荧光的原因可能是_________。为了让结果更加严谨，设置B、C两组对照，推测 B组的处理方式是_________。