1 . 利用乳酸菌构建表达抗原蛋白的工程菌是研究抗原应用的重要手段之一。口服的乳酸菌可在消化道内定植存活，其表达的抗原蛋白可锚定于细胞表面（穿过细胞膜展示在细胞表面），诱导机体产生免疫反应。科学家将某病毒抗原蛋白的部分编码序列（RBD）拼接成融合基因2RBD和3RBD，探究RBD的二聚体蛋白和三聚体蛋白能否模拟抗原蛋白中RBD的天然构象并获得高效免疫原性。重组质粒构建流程如图1所示，Nco I和Sac I是pNZ8149质粒上的限制酶识别位点，U-M为信号肽-细胞壁锚定蛋白序列。回答下列问题：

   

(1)为满足乳酸菌生长的特殊需求，培养基除了提供碳源、氮源、水和无机盐外，还需要添加___，并在___（填“有氧”或“无氧”）的环境条件下培养。
(2)拼接形成的融合基因不具备限制酶切割位点，利用PCR技术对融合基因进行扩增时，所用两种引物的5'端应分别添加___序列，以实现融合基因定向插入质粒。
(3)为鉴定重组质粒是否构建成功，将重组质粒双酶切处理后电泳，结果如图2，泳道1为双酶切pNZ8149-2RBD，泳道2为双酶切pNZ8149-3RBD。泳道1两个条带大小分别为2507bp和2020bp，由此可知，融合基因3RBD的长度为___bp，泳道2呈现一个条带的原因是___。
(4)实验成功构建了表达融合蛋白的重组乳酸菌，结果发现，在蛋白表达量和稳定性相同的情况下，pNZ8149-2RBD菌株表面二聚体蛋白的含量比pNZ8149-3RBD菌株表面三聚体蛋白多，该现象说明___。

2 . 将野生型谷氨酸棒状杆菌利用同源重组（将外源目的基因与受体的同源序列交换）的方法敲除葡萄糖转运系统关键酶基因ptsG，可以实现葡萄糖转运阻断，为分子水平研究葡萄糖转运提供参考。ptsG基因敲除质粒构建过程如图1所示，其中KanR是抗生素抗性基因，SacB是将蔗糖转变为果聚糖的基因，果聚糖积累对细菌有毒害，XhoI、EcoRI的识别序列和切割位点分别是—C↓TCGAG—、—G↓AATTC—。据此回答下列问题：

   

(1)图1中利用PCR获得上同源臂或下同源臂区段至少需要扩增_________轮。从引物角度分析，扩增得到上、下同源臂能拼接到一起的关键是_________。ptsG基因敲除质粒构建过程中，选用XhoI和EcoRI双酶切的优点是_________。
(2)将敲除ptsG基因质粒导入工程菌中能实现扩增。在工程菌筛选时，可分别接种到含卡那霉素培养基、含10%蔗糖培养基，_________（填“仅能在含卡那霉素”“仅能在含10%蔗糖”或“两种”）培养基上生长的为目的菌。
(3)将筛选得到的敲除ptsG基因质粒导入野生型容氨酸棒状杆菌，通过两次同源重组可敲除ptsG基因（如图2）。
①两次同源重组共有_________个磷酸二酯键的断裂（或合成）。验证同源重组是否成功，可以设计特定的引物进行PCR，通常将扩增产物利用_________方法鉴定。
②若从细胞水平上证明谷氨酸棒状杆菌的ptsG基因敲除成功，还需要将该菌和野生型谷氨酸棒状杆菌分别培养在以葡萄糖为唯一碳源的_________培养基上，该菌对葡萄糖的利用率明显比野生型菌_________。

3 . 灰霉病是由灰葡萄孢（一种真菌）引起的农作物病害。为了绿色、高效地防治灰霉病，研究人员从灰霉病多发的大棚土壤中取样、分离出多种单菌落并进行扩大培养，随后将各组微生物的无菌发酵滤液与未凝固的普通培养基混合后倒平板，冷却后在平板中央接种灰葡萄孢，通过比较灰葡萄孢菌丝生长情况，从而筛选出高效的灰葡萄孢拮抗菌。下列叙述，错误的是（　　）

A．在灰霉病多发的大棚土壤取样，比普通土壤更有可能获得灰葡萄孢拮抗菌

B．取无菌发酵滤液的目的是用拮抗菌的代谢产物对灰葡萄孢产生抑制作用

C．为筛选出高效拮抗菌，只需在普通培养基接种等量灰葡萄孢作为对照

D．灰葡萄孢菌丝生长最缓慢、稀疏的组别对应的微生物即为最高效拮抗菌

4 . γ-氨基丁酸（GABA）在疾病治疗方面具有重要价值。微生物生产 GABA安全性高、绿色环保、周期短、成本低，但其产量受到多种因素制约。为提高GABA产量，科研人员采取了多种策略。回答下列问题：
(1)基因1控制酶1合成，催化谷氨酸（Glu）脱羧生成 GABA．基因2控制酶2的合成，酶 2催化 GABA生成琥珀酸半醛。基因3 控制转运蛋白1合成，转运蛋白1将 Glu转运到胞内，将GABA 转运到胞外。基因4控制转运蛋白2合成，转运蛋白2将胞外的GABA 转运至胞内。因此，可采取的策略是上调基因_____的表达水平，敲除基因_____。
(2)野生型菌种内源性酶1的活力较低，外源基因SNO1（675bp）和SNZ1（894bp）的表达产物能提高酶1的活性。科研人员拟利用原始质粒 A 构建重组质粒 B，利用重组质粒 B构建重组质粒C（如图），并在大肠杆菌中表达。

①PCR扩增前，可从_____中获知基因1、SNO1和SNZ1的碱基序列，然后设计含相应酶切位点的引物。扩增基因1时的引物应含_____和_____酶切位点。
②目的基因与载体连接后，将重组质粒导入大肠杆菌，将大肠杆菌涂布在含_____的平板上培养，挑选菌落提取质粒。通过对质粒进行双酶切和_____初步检验重组质粒构建是否成功，结果如图。泳道4是重组质粒C被_____和_____双酶切的结果。重组质粒B的酶切产物位于泳道_____，重组质粒C的酶切产物位于泳道4和_____。

③利用转基因大肠杆菌进行发酵，结果发现，与导入重组质粒 B的大肠杆菌相比，导入重组质粒C的大肠杆菌生产GABA的产量低，可能原因是_____基因的表达需消耗较多的物质与能量，不利于 GABA的合成。
(3)酶1在低pH值下发挥作用，而大多数微生物的最适生长条件pH偏中性，因此在发酵中可采取的策略是_____。

5 . PET是一种聚酯类塑料，全球每分钟生产约100万个PET塑料瓶。科学家从能够利用PET作为碳源的细菌中分离出了一种能降解PET的解聚酶。PET在70℃时才能完全变为液态，便于降解，但PET解聚酶不耐高温。为此，科研人员借助定向进化策略，提高PET解聚酶耐受高温的能力。该策略经历多轮定向进化（每一轮均在上一轮筛选出的目标菌株上开展），其涉及的信息如表所示。

每一轮的基本流程	定向进化（轮次）
	第一轮	第二轮	第三轮	第四轮	第五轮	第六轮
①基因突变和转化	将突变后的PET解聚酶基因导入大肠杆菌
②分离纯化和鉴定的菌株	5种	13种	4种	3种	5种	9种
③提取出的PET解聚酶预保温和酶活测定条件	1h/55℃	1h/60℃	1h/65℃	1h/70℃	1h/80℃	7h/70℃
④选出的PET解聚酶中变化的位点数	2个	1个	2个	3个	3个	5个

(1)研究人员从土壤样品中分离能产生PET解聚酶的细菌时，所使用的培养基成分应包括____________（编号选填）。
①（NH₄）₂SO₄   ②淀粉   ③PET   ④无机盐
(2)据所学知识判断，分离PET解聚酶的细菌所使用的培养基类型属于____________．（编号选填）
①天然培养基   ②合成培养基   ③液体培养基
④通用培养基   ⑤固体培养基   ⑥选择培养基
(3)表中流程②宜选用的接种方法为_____________（平板划线/稀释涂布），其目的是_______。
A.对大肠杆菌进行计数                    
B．扩大大肠杆菌种群数量
C．便于分离提取PET解聚酶             
D．将导入不同突变基因的大肠杆菌分离开
(4)本研究采用的定向进化策略，相比自然界的进化过程，区别是_______。

A．发生基因突变	B．实现个体进化
C．加快进化速度	D．模拟自然选择

(5)据题干及所学知识分析，研究人员在第6轮中设置70℃且长时间保温（7小时）的目的是______________。
(6)据题干信息判断，获取耐高温PET解聚酶的过程涉及_____。

A．基因工程

B．细胞工程

C．发酵工程

D．蛋白质工程

天然PET解聚酶基因（792bp）部分编码链序列以及用于表达载体构建的质粒结构如下图所示：
5’ATGCAGACTAACCCCTATGCTCGCGGG………GATTTTCGCACTGCTAACTGCAGC3'

(7)已知天然PET解聚酶基因不含合适的酶切位点，但可借助PCR解决该问题。据图信息判断，为了便于表达载体的构建，在设计PET解聚酶基因PCR反应体系时，应选择引物_____________。（编号选填）
①5’TACATATGCAGACTAACCCCTATGCTCG3’
②5’TGCTCGAGATGCAGACTAACCCCTATGC3’
③5’TACATATGGCTGCAGTTAGCAGTG3’
④5’TGCTCGAGGCTGCAGTTAGCAGTG3’
(8)为鉴定表达载体构建是否正确，研究人员从目标菌株中提取质粒，并经XhoI和NdeI充分处理后进行凝胶电泳。根据下图结果判断，含目的基因的菌落是___________。

6 . 为了将某纳米抗体和绿色荧光蛋白基因融合表达，运用重组酶技术构建质粒，如图1所示。请回答下列问题：

   

(1)分别进行PCR扩增片段F1与片段F2时，配制的两个反应体系中不同的有______，扩增程序中最主要的不同是______。
(2)有关基因序列如图2．引物F2-F、F1-R应在下列选项中选用______。
   

A．ATGGTG------CAACCA

B．TGGTTG------CACCAT

C．GACGAG------CTGCAG

D．CTGCAG------CTCGTC’

(3)将PCR产物片段与线性质粒载体混合后，在重组酶作用下可形成环化质粒，直接用于转化细菌。这一过程与传统重组质粒构建过程相比，无需使用的酶主要有_______。
(4)转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选，下列叙述错误的有_______。

A．稀释涂布平板需控制每个平板30~300个菌落

B．抗性平板上未长出菌落的原因一般是培养基温度太高

C．抗性平板上常常会出现大量杂菌形成的菌落

D．抗性平板上长出的单菌落无需进一步划线纯化

(5)为了验证平板上菌落中的质粒是否符合设计，用不同菌落的质粒为模板，用引物F1-F和F2-R进行了PCR扩增，质粒P1~P4的扩增产物电泳结果如图3．根据图中结果判断，可以舍弃的质粒有______。

   

(6)对于PCR产物电泳结果符合预期的质粒，通常需进一步通过基因测序确认，原因是______。

7 . 乙醇作为可再生清洁能源，具有良好的应用前景。酵母菌可利用纤维素生产乙醇，此过程中产生的乙酸等物质会抑制酵母菌的生长和发酵，进而影响乙醇的产量。为选择合适的菌株，提高乙醇产量，科研人员进行下列实验。
(1)酵母菌细胞通过____________（填生理过程）产生乙醇，此生理过程的场所是____________。
(2)科研人员基于前期实验，获得两株高表达MRP8的酵母菌菌种P1和P2。将菌种________后，分别涂布于不同的培养基上，培养一段时间后，记录菌落生长情况，结果如图1。实验结果表明__________。

   

(3)将野生型酵母菌和P2菌分别接种于含4.8g/L乙酸的两个发酵罐中。一段时间后，检测发酵罐中葡萄糖消耗量和乙醇的生成量，结果如图2。

   

科研人员认为：在实际生产中，使用P2菌株比使用野生型菌株更有利用提高乙醇产量，判断的依据是______。
(4)高浓度乙酸会导致野生型酵母菌细胞内活性氧自由基（ROS） 积累，引起细胞器损伤，加速细胞衰老， 乙醇产量下降。为抵御ROS的伤害，野生型酵母菌细胞内SOD1增加，清除部分ROS。研究发现，与无乙酸条件相比，在5g/L乙酸条件下P2中MRP8表达量提高了约11倍、SOD1的表达量明显降低。依据上述信息， 完善P2菌株乙酸耐受的机理：
乙酸→诱导____________→____________ →细胞器损伤程度降低→提高乙醇生产强度

8 . 酵母菌的液泡中存在着多种水解酶，其中包括CPY（羧肽酶）和API（氨肽酶I）。科研人员对CPY和API的运输途径进行了研究。
(1)CPY和API在细胞内的______上合成，进入液泡后，能够催化蛋白质的分解，使液泡具有了类似______（填细胞器名称）的功能，进而调节细胞内的环境。
(2)已有研究表明，通过内质网-高尔基体途径进入液泡的蛋白质，要经过在内质网中切除信号肽、在高尔基体中糖基化（添加糖链）、进入液泡后再切除肽段，才能成熟。为判断CPY和API进入液泡的途径，科研人员进行了下列实验。
①实验一：科研人员提取这两种蛋白质，利用电泳技术检测二者加工前后分子量的变化，结果如下图1。B组与A组相比，加入衣霉素2小时后，蛋白质分子量______；API成熟过程中______（有/没有）糖基化，推断API的加工过程可能与CPY不同。

注：衣霉素能抑制蛋白质的糖基化
②实验二：利用温度敏感型酵母菌突变体sec（高温下，内质网到高尔基体囊泡运输受阻）进行实验，在高温和常温下检测CPY和API是否加工成熟，实验结果如下图2所示。由电泳结果可以判断，CPY和API进入液泡的途径分别是______。
A.CPY和API都经过内质网-高尔基体途径进入液泡
B.CPY和API都不经过内质网-高尔基体途径进入液泡
C.CPY经过内质网-高尔基体途径进入液泡，API不是
D.API经过内质网-高尔基体途径进入液泡，CPY不是
(3)科研人员对API进入液泡的途径提出了两种假说：一是API的肽链一边合成，一边穿过液泡膜；二是API在细胞质基质中被生物膜包裹形成小泡，而后进入液泡。科研人员在电子显微镜下观察野生型和另一种酵母菌突变体cvt（API蛋白质无法成熟），结果如下图3。


注：液泡内的黑色颗粒是API的位置；箭头所指为包裹着API的小泡。
①据观察，API进入液泡的途径符合假说______。
②尝试解释野生型和突变体cvt液泡内API存在方式不同的原因______。

9 . 四尾栅藻是一种淡水藻类，繁殖快、适应性强，可作为制备生物柴油的重要原料之一。为提高四尾栅藻油脂含量，研究人员将从含油量高的紫苏中获得的二酰甘油酰基转移酶基因（DGAT1）与pBI121质粒构建表达载体，经转化成功获得高产油脂四尾栅藻，主要研究过程如下图，其中DGAT1-F（5'-GCATCTAGAATGGCGATCTTGGACTC-3'）和DGAT1-R（5'-CGGATCCCTACCTTGCACTAGCTTTTC-3'）是以DGAT1基因为依据设计的一对引物，1acZ基因编码产物在X-ga1和IPTG存在下，可以产生蓝色沉淀，使菌落呈现蓝色，否则菌落呈现白色。请回答下列问题。

(1)过程①中需要的酶有____________，过程②应选用的限制酶是____________和____________。
(2)研究中，在保存DGAT1基因时，将克隆载体导入大肠杆菌的优点有____________。
①稳定保存②准确复制③快速表达④方便取用
(3)过程③经转化的大肠杆菌通过____________（方法）接种到培养基上继续培养。为筛选获得目标菌株，培养基应加入的成分有____________。
(4)为检测表达载体转化四尾栅藻的情况及确定目的基因是否表达，研究人员进行了如下实验，请完成下表。

实验步骤	简要操作过程
初筛培养	经转化后的四尾栅藻接种于含①____________的BG11固体培养基并放置于人工气候箱培养，一段时间后观察其生长情况
②____________	在BG11固体培养基上分别挑取数个单藻落接种至BG11液体培养基中光照摇床培养，编号备用
PCR验证	收集四尾栅藻藻体，提取基因组DNA，以DGAT1-F和DGAT1-R为引物，进行PCR验证，未转化的四尾栅藻作对照
油脂含量测定	利用索氏抽提法分别测定③____________的油脂含量
结果处理	统计并比较PCR验证结果及藻体中油脂的含量

10 . 绍兴是黄酒之乡，“麦曲酶长，酵米复芳；白梅酒酿，伴淋寒香；压滤琼浆，煎煮陈藏”是对绍兴黄酒精致复杂酿造工艺的描述。在黄酒的主发酵过程中，“开耙”（搅拌）是极为关键的一步。下列相关叙述错误的是（       ）

A．接种麦曲有利于淀粉的糖化，有利于“酒酿”菌种发酵

B．煎煮的目的是除去发酵产品中的杂菌，利于酵母菌繁殖

C．陈藏有利于黄酒中醇与酸发生酯化反应，使酒更加芳香

D．发酵过程中“开耙”可适当提供O2，调节pH，活化酵母