1 . 利用乳酸菌构建表达抗原蛋白的工程菌是研究抗原应用的重要手段之一。口服的乳酸菌可在消化道内定植存活，其表达的抗原蛋白可锚定于细胞表面（穿过细胞膜展示在细胞表面），诱导机体产生免疫反应。科学家将某病毒抗原蛋白的部分编码序列（RBD）拼接成融合基因2RBD和3RBD，探究RBD的二聚体蛋白和三聚体蛋白能否模拟抗原蛋白中RBD的天然构象并获得高效免疫原性。重组质粒构建流程如图1所示，Nco I和Sac I是pNZ8149质粒上的限制酶识别位点，U-M为信号肽-细胞壁锚定蛋白序列。回答下列问题：

   

(1)为满足乳酸菌生长的特殊需求，培养基除了提供碳源、氮源、水和无机盐外，还需要添加___，并在___（填“有氧”或“无氧”）的环境条件下培养。
(2)拼接形成的融合基因不具备限制酶切割位点，利用PCR技术对融合基因进行扩增时，所用两种引物的5'端应分别添加___序列，以实现融合基因定向插入质粒。
(3)为鉴定重组质粒是否构建成功，将重组质粒双酶切处理后电泳，结果如图2，泳道1为双酶切pNZ8149-2RBD，泳道2为双酶切pNZ8149-3RBD。泳道1两个条带大小分别为2507bp和2020bp，由此可知，融合基因3RBD的长度为___bp，泳道2呈现一个条带的原因是___。
(4)实验成功构建了表达融合蛋白的重组乳酸菌，结果发现，在蛋白表达量和稳定性相同的情况下，pNZ8149-2RBD菌株表面二聚体蛋白的含量比pNZ8149-3RBD菌株表面三聚体蛋白多，该现象说明___。

3 . 将野生型谷氨酸棒状杆菌利用同源重组（将外源目的基因与受体的同源序列交换）的方法敲除葡萄糖转运系统关键酶基因ptsG，可以实现葡萄糖转运阻断，为分子水平研究葡萄糖转运提供参考。ptsG基因敲除质粒构建过程如图1所示，其中KanR是抗生素抗性基因，SacB是将蔗糖转变为果聚糖的基因，果聚糖积累对细菌有毒害，XhoI、EcoRI的识别序列和切割位点分别是—C↓TCGAG—、—G↓AATTC—。据此回答下列问题：

   

(1)图1中利用PCR获得上同源臂或下同源臂区段至少需要扩增_________轮。从引物角度分析，扩增得到上、下同源臂能拼接到一起的关键是_________。ptsG基因敲除质粒构建过程中，选用XhoI和EcoRI双酶切的优点是_________。
(2)将敲除ptsG基因质粒导入工程菌中能实现扩增。在工程菌筛选时，可分别接种到含卡那霉素培养基、含10%蔗糖培养基，_________（填“仅能在含卡那霉素”“仅能在含10%蔗糖”或“两种”）培养基上生长的为目的菌。
(3)将筛选得到的敲除ptsG基因质粒导入野生型容氨酸棒状杆菌，通过两次同源重组可敲除ptsG基因（如图2）。
①两次同源重组共有_________个磷酸二酯键的断裂（或合成）。验证同源重组是否成功，可以设计特定的引物进行PCR，通常将扩增产物利用_________方法鉴定。
②若从细胞水平上证明谷氨酸棒状杆菌的ptsG基因敲除成功，还需要将该菌和野生型谷氨酸棒状杆菌分别培养在以葡萄糖为唯一碳源的_________培养基上，该菌对葡萄糖的利用率明显比野生型菌_________。

4 . 灰霉病是由灰葡萄孢（一种真菌）引起的农作物病害。为了绿色、高效地防治灰霉病，研究人员从灰霉病多发的大棚土壤中取样、分离出多种单菌落并进行扩大培养，随后将各组微生物的无菌发酵滤液与未凝固的普通培养基混合后倒平板，冷却后在平板中央接种灰葡萄孢，通过比较灰葡萄孢菌丝生长情况，从而筛选出高效的灰葡萄孢拮抗菌。下列叙述，错误的是（　　）

A．在灰霉病多发的大棚土壤取样，比普通土壤更有可能获得灰葡萄孢拮抗菌

B．取无菌发酵滤液的目的是用拮抗菌的代谢产物对灰葡萄孢产生抑制作用

C．为筛选出高效拮抗菌，只需在普通培养基接种等量灰葡萄孢作为对照

D．灰葡萄孢菌丝生长最缓慢、稀疏的组别对应的微生物即为最高效拮抗菌

7 . γ-氨基丁酸（GABA）在疾病治疗方面具有重要价值。微生物生产 GABA安全性高、绿色环保、周期短、成本低，但其产量受到多种因素制约。为提高GABA产量，科研人员采取了多种策略。回答下列问题：
(1)基因1控制酶1合成，催化谷氨酸（Glu）脱羧生成 GABA．基因2控制酶2的合成，酶 2催化 GABA生成琥珀酸半醛。基因3 控制转运蛋白1合成，转运蛋白1将 Glu转运到胞内，将GABA 转运到胞外。基因4控制转运蛋白2合成，转运蛋白2将胞外的GABA 转运至胞内。因此，可采取的策略是上调基因_____的表达水平，敲除基因_____。
(2)野生型菌种内源性酶1的活力较低，外源基因SNO1（675bp）和SNZ1（894bp）的表达产物能提高酶1的活性。科研人员拟利用原始质粒 A 构建重组质粒 B，利用重组质粒 B构建重组质粒C（如图），并在大肠杆菌中表达。

①PCR扩增前，可从_____中获知基因1、SNO1和SNZ1的碱基序列，然后设计含相应酶切位点的引物。扩增基因1时的引物应含_____和_____酶切位点。
②目的基因与载体连接后，将重组质粒导入大肠杆菌，将大肠杆菌涂布在含_____的平板上培养，挑选菌落提取质粒。通过对质粒进行双酶切和_____初步检验重组质粒构建是否成功，结果如图。泳道4是重组质粒C被_____和_____双酶切的结果。重组质粒B的酶切产物位于泳道_____，重组质粒C的酶切产物位于泳道4和_____。

③利用转基因大肠杆菌进行发酵，结果发现，与导入重组质粒 B的大肠杆菌相比，导入重组质粒C的大肠杆菌生产GABA的产量低，可能原因是_____基因的表达需消耗较多的物质与能量，不利于 GABA的合成。
(3)酶1在低pH值下发挥作用，而大多数微生物的最适生长条件pH偏中性，因此在发酵中可采取的策略是_____。

9 . PET是一种聚酯类塑料，全球每分钟生产约100万个PET塑料瓶。科学家从能够利用PET作为碳源的细菌中分离出了一种能降解PET的解聚酶。PET在70℃时才能完全变为液态，便于降解，但PET解聚酶不耐高温。为此，科研人员借助定向进化策略，提高PET解聚酶耐受高温的能力。该策略经历多轮定向进化（每一轮均在上一轮筛选出的目标菌株上开展），其涉及的信息如表所示。

每一轮的基本流程	定向进化（轮次）
	第一轮	第二轮	第三轮	第四轮	第五轮	第六轮
①基因突变和转化	将突变后的PET解聚酶基因导入大肠杆菌
②分离纯化和鉴定的菌株	5种	13种	4种	3种	5种	9种
③提取出的PET解聚酶预保温和酶活测定条件	1h/55℃	1h/60℃	1h/65℃	1h/70℃	1h/80℃	7h/70℃
④选出的PET解聚酶中变化的位点数	2个	1个	2个	3个	3个	5个

(1)研究人员从土壤样品中分离能产生PET解聚酶的细菌时，所使用的培养基成分应包括____________（编号选填）。
①（NH₄）₂SO₄   ②淀粉   ③PET   ④无机盐
(2)据所学知识判断，分离PET解聚酶的细菌所使用的培养基类型属于____________．（编号选填）
①天然培养基   ②合成培养基   ③液体培养基
④通用培养基   ⑤固体培养基   ⑥选择培养基
(3)表中流程②宜选用的接种方法为_____________（平板划线/稀释涂布），其目的是_______。
A.对大肠杆菌进行计数                    
B．扩大大肠杆菌种群数量
C．便于分离提取PET解聚酶             
D．将导入不同突变基因的大肠杆菌分离开
(4)本研究采用的定向进化策略，相比自然界的进化过程，区别是_______。

A．发生基因突变	B．实现个体进化
C．加快进化速度	D．模拟自然选择

(5)据题干及所学知识分析，研究人员在第6轮中设置70℃且长时间保温（7小时）的目的是______________。
(6)据题干信息判断，获取耐高温PET解聚酶的过程涉及_____。

A．基因工程

B．细胞工程

C．发酵工程

D．蛋白质工程

天然PET解聚酶基因（792bp）部分编码链序列以及用于表达载体构建的质粒结构如下图所示：
5’ATGCAGACTAACCCCTATGCTCGCGGG………GATTTTCGCACTGCTAACTGCAGC3'

(7)已知天然PET解聚酶基因不含合适的酶切位点，但可借助PCR解决该问题。据图信息判断，为了便于表达载体的构建，在设计PET解聚酶基因PCR反应体系时，应选择引物_____________。（编号选填）
①5’TACATATGCAGACTAACCCCTATGCTCG3’
②5’TGCTCGAGATGCAGACTAACCCCTATGC3’
③5’TACATATGGCTGCAGTTAGCAGTG3’
④5’TGCTCGAGGCTGCAGTTAGCAGTG3’
(8)为鉴定表达载体构建是否正确，研究人员从目标菌株中提取质粒，并经XhoI和NdeI充分处理后进行凝胶电泳。根据下图结果判断，含目的基因的菌落是___________。