1 . 大量研究表明，家畜的肉类产量与肌生长抑制素（MSTN）基因有关，MSTN蛋白在体内主要调控骨骼肌的生长发育。多种动物研究已经证实，敲除基因MSTN可以显著增加动物的肌肉质量。科研人员希望利用CRISPR/Cas9基因编辑系统获得敲除了基因MSTN的家禽。请回答下列问题：

(1)CRISPR/Cas9基因编辑系统原理如图1，Cas9酶可催化DNA分子的断裂，实现对目的基因的特异性切割，在切割过程中破坏的化学键是____________。图中向导RNA的作用是定向引导Cas9蛋白与靶向基因结合，其原理是____________。
(2)科研人员希望在鸡胚细胞中表达CRISPR/Cas9基因编辑系统，构建的基因表达载体如图2。

①在对向导RNA对应的DNA片段进行PCR扩增时，需要在其两端分别添加限制酶____________、____________的识别序列。
②用①中限制酶切割质粒和向导RNA对应的DNA片段，选择这种酶切方式的目的是____________。
③基因表达载体上，除了图示序列和标记基因外，还需要连接的DNA片段是____________。
(3)将鸡胚分为三组并提取DNA，用图2中的引物Ⅰ和引物Ⅱ进行PCR扩增，并对PCR结果进行电泳检测，结果如图3。

1组电泳的结果小于2组，其原因是____________。3组电泳无结果，其原因是____________。

2 . 东北酸菜是白菜经腌制而成的传统食品。发酵过程中若霉菌等微生物大量繁殖会导致酸菜腐败发臭。研究人员从酸菜中分离出具有抑菌活性的乳酸菌，该类乳酸菌因能分泌新型细菌素（多肽）而具有抑菌活性。为获得细菌素表达量更高的工程菌用于生产，进行了相关研究。回答下列问题。
(1)乳酸菌产生的乳酸能溶解碳酸钙而产生溶钙圈。研究人员为从市售多个品牌的酸菜中分离纯化乳酸菌，配制含有碳酸钙的固体培养基，利用_____法对该培养基进行灭菌，并采用_____法将酸菜液接种到培养基中，选择有溶钙圈的菌落并继续进行纯培养。
(2)通过上述方法筛选得到6种乳酸菌，测得它们对霉菌的抑菌率如下表，应选择乳酸菌编号为_____的菌株进行后续操作。

乳酸菌编号	Ll	L2	L3	L4	L5	L6
抑菌率/%	28．57	19．48	58．44	14．28	6．49	36．36

(3)研究人员从上述乳酸菌中提取细菌素基因，将其导入受体菌，再对受体菌做进一步的检测与鉴定。下面是细菌素基因及构建的基因表达载体的示意图。

①利用PCR技术扩增细菌素基因时，应选择的一对引物是_____。PCR过程中，经过4轮循环，消耗引物的个数是_____。
②若以细菌素基因甲链为转录的模板链，为构建基因表达载体，应在与甲链结合的引物的5＇端加入_____（填“BamH I”或“Nde I”）的识别序列。
③转化操作后提取受体细胞中的DNA，并利用选择的引物进行扩增，再对扩增产物进行电泳检测，结果如下图。

1：DNA标准样 2：普通受体菌的DNA 3：转化操作后受体菌的DNA 4：无菌水

设置4号的目的是_____（答出1点即可），电泳结果表明_____。

3 . 土壤盐渍化会影响水稻生长发育，研究人员将水稻耐盐碱基因OsMYB56导入不耐盐碱水稻品种吉粳88中，培育耐盐碱水稻新品种，其操作流程及可能用到的限制酶如图所示，其中Tet^R为四环素抗性基因，Amp^R为氨苄青霉素抗性基因，①~⑤表示操作过程。回答下列问题：

限制酶	BanHI	BclI	SmaI	Sau3AI
识别位点及切割位点	－G↓GATCC－	－T↓GATCA－	－CCC↓GGG－	－↓GATC－

(1)为了防止质粒自身环化，保证OsMYB56基因和酶切后的质粒定向连接，在目的基因复制前，设计PCR引物时最好在引物的_______端添加含有限制酶______的识别序列。根据上图信息可知，设计的引物序列一种是5'－CCCGGGTCTGTTGAAT－3'，另一种是_______（共写出16个碱基的序列）。
(2)过程②中需要先用_______处理根瘤农杆菌，使根瘤农杆菌处于_______的状态，以便将基因表达载体导入细胞。
(3)过程③中利用了质粒中的T－DNA______的特点；过程④中，从愈伤组织到幼苗的培养过程需要的激素主要有生长素和________，该过程还需要光照，其作用是______（答出1点）。

4 . 传统的基因测序往往需要从大量细胞中提取DNA。科研人员应用单细胞基因组扩增技术，成功地在体外对分离得到的极体进行了基因组扩增（PCR），并完成了测序，从而推测出与被测极体同时产生的卵细胞不含致病基因，最终借助试管婴儿技术帮助女性遗传病患者获得健康婴儿，试管婴儿技术涉及体外受精、胚胎移植等技术。下列有关叙述，正确的是（　　）

A．被测极体的单细胞基因组只包含一个染色体组上的基因

B．体外扩增DNA需要引物，体内DNA复制不需要引物

C．精子获能指精子在获能液中获得ATP后才具备受精能力

D．PCR反应缓冲溶液中要添加Mg2+、耐高温的DNA解旋酶

5 . 光敏色素基因在调节作物生长发育中具有重要作用。为探讨玉米中光敏色素基因A（含大约256个碱基对）在棉花种质资源创制中的利用价值，研究人员将A基因转入到棉花中，利用对棉花受体细胞进行检测，并通过电泳技术分析结果。该过程所用质粒与含光敏色素基因的DNA上相关限制酶的酶切位点分别如图甲、乙所示，电泳检测结果如图丙。下列相关叙述错误的是（       ）

A．操作过程中需要用到的工具有限制性内切核酸酶、DNA连接酶和载体

B．构建表达载体时应选用BamHI和HindⅢ这两种限制酶

C．PCR反应过程中每次循环都要经历目的各不相同的两次升温和一次降温

D．由图丙电泳结果可知，1、2、3、4号转基因棉花均培育成功

6 . 环境DNA（eDNA——环境中的总DNA）技术在鱼类生态学中应用的基本方法是：从目标水体环境（如池塘）中获得eDNA，对鱼类科、属、种等的特定核酸序列扩增、定量和测序。应用该技术理论上不易实现的是（     ）

A．外来物种入侵的监测	B．种群年龄结构的建立
C．两个种群密度的比较	D．两个物种生物量的比较

7 . 下图为DNA分子在不同酶的作用下所发生的变化，图中依次表示限制性内切核酸酶、DNA聚合酶、DNA连接酶、解旋酶作用的正确顺序是（       ）

A．①②③④	B．①②④③
C．①④②③	D．①④③②

8 . 研究人员利用转基因技术改造乳酸杆菌，将其添加于饲料中，以提高家禽养殖效率。枯草芽孢杆菌能分泌一种可降解纤维素的酶，这种酶由W基因编码。为在乳酸杆菌中表达W基因，需使用图1中质粒为载体，图2为含W基因的DNA片段。
   
(1)采用_____________技术可以快速、大量获得W基因。利用该技术扩增目的基因时，需要____________等作为原料和直接能源物质。
(2)启动子是____________识别和结合的部位。很多启动子具有物种特异性，在图1质粒中插入W基因，其上游启动子应选择____________（填写字母）。
A．枯草芽孢杆菌启动子     B．乳酸杆菌启子   C．农杆菌启动子
(3)根据图1和图2，应使用限制酶____________切割图2中含W基因的DNA片段，导入质粒以获得能正确表达W基因的重组质粒。所得重组质粒转化乳酸杆菌后，使用含_____________的培养基筛选，以得到转入W基因的乳酸杆菌。
(4)目的基因导入受体细胞后，常用_________技术检测目的基因是否翻译出降解纤维素的酶。
(5)为确定导入重组质粒的乳酸杆菌是否具有分解纤维素的能力，研究人员用液体培养基分别培养下表所示菌种。取部分菌液上清液测定酶活力，实验方案及测定结果如下表所示。表中的X应为____________。

菌种	酶活性相对值
乳酸杆菌	未检出
X	未检出
导入了重组质粒的乳酸杆菌	0.96

9 . 微生物吸附是重金属废水的处理方法之一。金属硫蛋白（MT）是一类广泛存在于动植物中的金属结合蛋白，具有吸附重金属的作用。科研人员将枣树的MT基因导入大肠杆菌构建工程菌。请分析并回答下列问题。
   
(1)从枣树相关细胞中提取____，通过逆转录获得枣树的MTcDNA，然后根据枣树MTcDNA的核苷酸序列设计了相应的引物（图1甲），以通过PCR扩增MT基因。已知A位点和B位点分别是起始密码子和终止密码子对应的基因位置。选用的引物组合应为____，这些引物的长度一般包含15～23个碱基，过短会导致特异性差，过长则会导致____。若1个MTcDNA扩增n次，则总共消耗引物____个。
(2)本实验中，PCR所用的____酶扩增出的MT基因，其末端为平末端。由于载体E只有能产生黏性末端的酶切位点，需借助中间载体P将MT基因接入载体E。载体P和载体E的酶切位点及相应的酶切序列如图1乙所示。
①选用____酶将载体P切开，再用____酶将MT基因与载体P相连，构成重组载体P'。
②选用____酶的组合对载体P'和载体E进行酶切，将切下的MT基因和载体E用酶连接，将得到的混合物导入到用____离子处理的大肠杆菌，然后筛出MT工程菌。
(3)MT基因在工程菌的表达量如图2所示，结果仍无法说明已经成功构建能较强吸附废水中重金属的MT工程菌，以下叙述中能支持该观点的是____。
   
①尚未对MT工程菌合成的MT蛋白的活性进行测定
②尚未对MT工程菌吸附重金属的能力进行鉴定
③尚未在个体生物学水平进行抗原-抗体杂交
大肠杆菌MT工程菌
④尚未对MT基因进行碱基序列的测定和比较

10 . 玉米的祖先——野生玉米，名叫“大刍草”，经过9000多年人工驯化，被改造成现代玉米。我国中科院科学家经过长达10年不懈努力，从野生玉米“大刍草”中，成功找回玉米人工驯化过程中丢失的一个控制高蛋白含量的优良基因THP9，克隆出来并将此高蛋白基因转移到玉米细胞内，获得了转基因高蛋白玉米新品种。请回答相关问题：

EcoRI	BamHI	KpnI	MfeI	HindⅢ

(1)若科研人员获得了THP9基因对应核苷酸序列，则可利用DNA合成仪直接合成目的基因，该种获取目的基因的方法是___________。
①化学合成法②PCR法③基于大规模筛选的方法
(2)构建基因表达载体时，若科研人员需将THP9基因整合到质粒上，如图，已知图中THP9基因转录方向为从左往右，应使用限制酶______________切割如图中质粒，使用限制酶________________切割图中含THP9基因的DNA片段，以获得能正确表达THP9基因的重组质粒。
(3)限制酶来源于原核生物，不会切割本身的DNA分子是因为_____________________。
(4)TPH9基因转录的模板链是______，利用PCR技术对THP9基因进行扩增的原理是__________。
(5)为了检测转基因技术是否成功，科研工作者在个体水平上的检测方法是____________________。