1 . 防御素是一类富含二硫键的阳离子型多肽，广泛分布于真菌、植物与动物中，是生物免疫系统中的重要调节分子。β-防御素是一种由H基因编码的抗菌肽，抑菌谱广。长春生物科技研究所通过构建重组酵母菌进行发酵，获得了β-防御素。回答下列问题：
(1)为获得β-防御素基因，研究者利用致病细菌的脂多糖（LPS）刺激结肠癌细胞株提高β-防御素的表达量，提取总RNA，经过___________后，作为模板进行PCR扩增。PCR产物常采用___________来鉴定，鉴定后进行测序。测序结果与____________数据库中的公开数据进行比较，进而得到正确的β-防御素基因。
(2)本实验选用毕赤酵母表达载体pPIC9K（如图），扩增目的基因时设计的1对引物为P1（5'ATCGAATTCATGGGAAGTCATAAACACATTAGA3'）和P2（5'TATAGCGGCCGCCTATTTCTTTCTTCGGCAGCAT3'）。

①本实验中引物的作用是__________（答出2点即可）；
②部分限制酶识别序列及切点如下表，结合图中限制酶切点与引物，推测本实验酶切时，选用的两种限制酶是____________，采用双酶切法的优势是_________（答出2点即可）。

限制酶	识别序列及酶切位点
Bg! Il	5..A↓GATCT...3'
EcoR I .	5...G↓MTTC...3'
SnaB 1	S.'.TAC↓GTA..3'
Sac	5..-GAGAC↓C--.3'
Avr lI	5..C↓CTC...3'
SulI	G↓TCCGAC...
Not I	5.. CC↓GGGCCGC...3

(3)毕赤酵母表达系统最大的优点是可对β-防御素__________（答出2点即可），直接表达出具有生物活性的产品。
(4)毕赤酵母表达系统发酵结束后，采取适当的___________措施来获得产品。

2 . 人参是一种名贵中药材，具有良好的滋补作用。干扰素可用于治疗慢性乙肝、丙肝及部分肿瘤。下图为三种限制酶识别序列与酶切位点及制备能合成干扰素的人参愈伤组织细胞的示意图。请回答下列问题：

(1)图中①的DNA用限制酶HindⅢ、BamHⅠ完全酶切后，反应管中有________种DNA片段。利用PCR技术扩增干扰素基因时，扩增第n次时，需要________个引物。
(2)假设图中质粒上限制酶BamHⅠ识别位点的碱基序列变为了另一种限制酶BclⅠ识别位点的碱基序列，现用限制酶BclⅠ和HindⅢ切割质粒，那么该图中①的DNA右侧________(填“能”或“不能”)选择BamHⅠ进行切割，理由是________。若上述假设成立，并成功形成重组质粒，则重组质粒________(填字母)。
A．既能被BamHⅠ切开，也能被HindⅢ切开
B．能被BamHⅠ切开，但不能被HindⅢ切开
C．既不能被BamHⅠ切开，也不能被HindⅢ切开
D．能被HindⅢ切开，但不能被BamHⅠ切开
(3)在构建重组质粒的过程中，用HindⅢ、BamHⅠ切割质粒和目的基因比只用BamHⅠ好，这样可以防止_______________________。②过程需要用到的酶是________________。
(4)④过程检测人参愈伤组织细胞是否产生干扰素，所用的方法是_________________。
(5)在PCR过程中所用酶的最大理化特点是_________________。
(6)将构建的基因表达载体导入动物受精卵常用的方法是____________________。

3 . 用质粒(图1)和含目的基因的DNA片段(图2)构建基因表达载体获得转基因大肠杆菌，下列叙述错误的是（       ）

A．若通过PCR技术获取该目的基因，应该选用引物甲和引物丙

B．在受体细胞中，氨苄青霉素抗性基因和目的基因可同时表达

C．若将基因表达载体导入受体细胞中，需先用Ca2＋处理大肠杆菌

D．利用质粒和目的基因构建表达载体，应选用BclⅠ和HindⅢ剪切

4 . 下图示利用重叠延伸PCR技术改造目的基因的原理。相关叙述错误的是（       ）

   

A．图示操作中至少需要用2种限制酶对目的基因进行处理

B．操作中引物2和引物3序列应含有拟突变位点，且可以互补

C．应选用引物1和引物4进行PCR3，以获得大量目的基因序列

D．此过程实现的基因序列改变属于基因突变，未发生基因重组

5 . 多不饱和脂肪酸（PUFAs）是人体必需脂肪酸，为解决猪肉中PUFAs含量不足的问题，研究者从线虫中获得控制PUFAs合成的必需酶基因fatl，培育转fatl基因猪，操作过程如图所示。图中GFP基因表达出绿色荧光蛋白。据图回答下列问题：

(1)用PCR技术在体外扩增目的基因应用的是_____原理，PCR扩增仪中要加入缓冲液、目的基因、______（答出2点）等。
(2)由图可知，在构建基因表达载体时，为克服目的基因自身环化，即线性DNA的末端相互连接形成圆环，以及便于目的基因与载体的连接，切割含目的基因的DNA和载体的限制酶应选用_______和____。
(3)构建的基因表达载体中，GFP基因的作用是_____。除GFP基因外，未标注出的必需元件还有_______。
(4)猪成纤维细胞在培养瓶中培养时，除必须保证环境是无菌、无毒外，还必须定期_______，以防止细胞代谢物积累对细胞自身造成的伤害。培养到一定程度后，需要分瓶再继续培养，分瓶后的培养过程称为_____。此过程中，对于悬浮培养的细胞直接用___法收集细胞处理成细胞悬液。
(5)经检测，fatl基因成功整合在猪基因组DNA后，不能说明成功培育转基因猪，还需要_______。

6 . CRISPR/Cas9基因编辑技术根据靶基因序列设计向导sgRNA，精确引导核酸酶Cas9切割与sgRNA配对的DNA，相关酶在修复断裂DNA的过程中会改变连接部位的碱基序列。科研人员通过删除编码PD-1蛋白基因的2、3、4片段造成蛋白质的功能缺失，制作PD-1基因敲除鼠的流程如图1所示。将体外转录获得的Cas9mRNA和sgRNA导入小鼠的受精卵中，获得了12只基因编辑小鼠。利用PCR鉴定小鼠的基因型，电泳结果如图2所示。已知P1和P2是PCR的引物，下列相关分析正确的是（       ）

      

A．核酸酶 Cas9敲除2、3、4片段作用在磷酸二酯键，引起的变异属于基因重组

B．欲将基因的2、3、4共3个片段切除，敲除前需要设计3个向导sgRNA

C．图2中，4和12个体杂交的子代均为基因敲除纯合子（不考虑性别）

D．图2中，3、5、9个体的体内均能检测到PD-1基因，8和10个体则不能检测到该基因

7 . 药物A是从某植物体中提取的一种蛋白质，对治疗糖尿病具有良好的疗效。某研究团队运用生物工程相关技术，利用链霉菌来生产这种药物。如图所示为培养和筛选能生产药物A的链霉菌的过程。回答下列相关问题：

(1)科学家根据药物A的氨基酸序列人工合成DNA片段，由于_____，该方法得到的DNA片段有多种可能。若要运用PCR技术从植物的“基因海洋”中扩增出药物A基因，前提是_____。将重组DNA与载体连接导入链霉菌后，需要对重组链霉菌进行检测和鉴定。判断药物A基因是否成功表达出蛋白质常用_____技术进行检测。
(2)重组DNA中的P是启动子，它的作用是_____；Neo基因为卡那霉素抗性基因，它的主要作用是_____。
(3)将能生产药物A的链霉菌接种到生物发酵罐中，运用发酵工程大规模生产药物A．在发酵之前要对培育的链霉菌菌种进行_____，发酵过程中须监测和控制发酵罐中的温度、_____和溶解氧量等，使发酵过程维持在适宜状态。

8 . 为提高大豆对磷元素的吸收能力，研究人员利用农杆菌转化法将水稻的耐低磷基因OsPTF转移到大豆植株中，下图为重组Ti质粒上T—DNA的序列结构示意图。下列相关叙述错误的是（       ）

A．启动子1和启动子2具有的核苷酸序列一般是相同的

B．RNA聚合酶与启动子1识别并结合后，启动抗除草剂基因的转录

C．可通过含除草剂的选择培养基筛选含有目的基因大豆愈伤组织

D．用EcoRI、BamHI双酶切重组Ti质粒后，经电泳分离至少得到两条带

9 . 科学家培养出一种转基因小鼠，其膀胱上皮细胞可以合成人的生长激素并分泌到尿液中。下列说法错误的是（       ）

A．用显微注射法将人的生长激素基因导入小鼠受体细胞

B．人的生长激素基因只存在于在小鼠的膀胱上皮细胞中

C．可通过PCR技术检测转基因小鼠是否转录出目的基因的mRNA

D．在小鼠体内检测到人的生长激素基因，无法说明成功获得转基因小鼠

10 . 在生物医学领域，克隆技术被用于研究细胞增殖、组织或器官再生和人类疾病等方面。例如，利用克隆技术可以大量复制含有特定功能的细胞，并对其进行药效学和毒理学测试，以及疾病模型的制作。同时，克隆技术还可用于治疗一些遗传疾病。下列说法不属于克隆的是（       ）

A．利用PCR技术扩增目的基因	B．利用核移植技术培育出克隆动物
C．利用植物体细胞杂交技术培育出杂种植株	D．利用胡萝卜茎尖组织经植物组织培养得到脱毒苗