1 . 为研究耐旱基因（LEA）对甘蓝型油菜油脂的积累机制，科研人员构建了LEA基因与荧光素酶基因（Luc）表达载体，相关碱基序列及酶切位点如图所示。回答下列问题：

   

(1)由图可知，不能选择BamHI酶进行切割载体的理由是______________最好选择两种限制酶而不是一种限制酶进行酶切的理由是____________。
(2)利用PCR扩增LEA基因时，需要在LEA基因左右两端分别添加相应的限制酶EcoRV和XbaI识别序列，需要在引物的__________（填“3'端”或“5'端”）添加限制酶识别序列。一个LEA基因连续扩增4次，共需要__________个引物，依据图中已知碱基序列，在PCR扩增仪中加入的引物的碱基序列为__________（填下列序号）。

①5'-GATATCATGGGC-3'                           ②5'-TCTAGAATGGGC-3'

③5'-TCTAGACTAGTG-3'                           ④5'-GATATCCTAGTG-3'

(3)常用农杆菌转化法将目的基因导入油菜受体细胞，依据农杆菌的侵染特点，目的基因将插入到Ti质粒的__________上，经过转化作用，进入油菜细胞，并将其插入到__________，从而使其得以维持稳定和表达。

2 . 研究人员利用转基因技术改造乳酸杆菌，将其添加于饲料中，以提高家禽养殖效率。枯草芽孢杆菌能分泌一种可降解纤维素的酶，这种酶由W基因编码。为在乳酸杆菌中表达W基因，需使用图1中质粒为载体，图2为含W基因的DNA片段。
   
(1)采用_____________技术可以快速、大量获得W基因。利用该技术扩增目的基因时，需要____________等作为原料和直接能源物质。
(2)启动子是____________识别和结合的部位。很多启动子具有物种特异性，在图1质粒中插入W基因，其上游启动子应选择____________（填写字母）。
A．枯草芽孢杆菌启动子     B．乳酸杆菌启子   C．农杆菌启动子
(3)根据图1和图2，应使用限制酶____________切割图2中含W基因的DNA片段，导入质粒以获得能正确表达W基因的重组质粒。所得重组质粒转化乳酸杆菌后，使用含_____________的培养基筛选，以得到转入W基因的乳酸杆菌。
(4)目的基因导入受体细胞后，常用_________技术检测目的基因是否翻译出降解纤维素的酶。
(5)为确定导入重组质粒的乳酸杆菌是否具有分解纤维素的能力，研究人员用液体培养基分别培养下表所示菌种。取部分菌液上清液测定酶活力，实验方案及测定结果如下表所示。表中的X应为____________。

菌种	酶活性相对值
乳酸杆菌	未检出
X	未检出
导入了重组质粒的乳酸杆菌	0.96

3 . 抗菌肽通常是由短氨基酸序列构成的小肽，具有广谱的杀菌活性，利用基因工程生产抗菌肽的难题之一是大肠杆菌能识别外源蛋白并将其水解。某科研小组将抗菌肽基因与大肠杆菌自身的半乳糖苷酶基因连接，组成融合基因，通过质粒构建基因表达载体并导入大肠杆菌中，以获得大量的抗菌肽。如图1、图2为融合基因和该实验所用质粒的结构示意图。请回答下列问题：

注：EcoRⅠ、SmaⅠ、BamHⅠ、HindⅢ为不同的限制酶，Amp ⁸为氨苄青霉素抗性基因，Tetⁿ为四环素抗性基因。
(1)分析图1可知，利用PCR技术扩增融合基因时，应选择的引物是___________，这样选择的理由是___________（答出2点）。
(2)为构建重组质粒并保证基因能定向插入质粒中，需选择限制酶 ___________切割质粒和含融合基因的 DNA 片段。筛选重组质粒时，应将大肠杆菌分别接种到含氨苄青霉素和四环素的培养基上，若___________，则说明重组质粒成功导入大肠杆菌细胞内。上述培养基可为大肠杆菌的生长繁殖提供的营养物质有___________
(3)该实验利用大肠杆菌获得抗菌肽时，将抗菌肽基因和大肠杆菌自身的半乳糖苷酶基因组成融合基因的目的是___________。

4 . 人血清白蛋白(HSA)具有重要的医用价值，只能从人血浆中制备。下图是以基因工程技术获取重组HSA(rHSA)的两条途径。

(1)为获取HSA基因，首先需采集人的血液，提取________合成总cDNA，然后以cDNA为模板，使用PCR技术扩增HSA基因。下图中箭头表示一条引物结合模板的位置及扩增方向，请用箭头在方框内标出另一条引物的位置及扩增方向。
______
(2)启动子通常具有物种及组织特异性，构建在水稻胚乳细胞内特异表达rHSA的载体，需要选择的启动子是________(填写字母，单选)。

A．人血细胞启动子

B．水稻胚乳细胞启动子

C．大肠杆菌启动子

D．农杆菌启动子

(3)构建在水稻胚乳细胞内特异表达rHSA载体的过程中，用到的工具酶有限制酶和__________，其作用于__________键。
(4)人体合成的初始HSA多肽，需要经过膜系统加工形成正确空间结构才有活性。与途径Ⅱ相比，选择途径Ⅰ获取rHSA的优势是______________。
(5)为证明rHSA具有医用价值，须确认rHSA与___________的生物学功能一致。

5 . 荧光蛋白（GFP）在紫外光下会发出绿色荧光，某科研团队将GFP基因插入质粒P中构建了重组质粒载体P₀，用于基因工程中基因表达载体（P₁）的筛选和鉴定。部分过程如下图所示，下表为部分限制酶的识别序列及切割位点。回答问题：

(1)过程①中用EcoR V酶切获得的目的基因具有_____末端，过程②表示利用PCR技术扩增目的基因，前提是要根据_____设计出引物，此外还需在引物的_____端添加相应限制酶的识别序列，以便于P₁的构建和筛选。
(2)过程③中，质粒P₀需用限制酶_____切割，与扩增出的目的基因在_____酶作用下形成P₁。
(3)为了筛选出含有质粒P₁的菌落，需采用添加_____的培养基平板进行培养，在紫外光激发下_____的菌落，即为含有P₁的菌落。
(4)提取经上述筛选所得菌落的RNA，通过_____获得DNA，再进行PCR扩增，若最终未能检测出目的基因，可能的原因是_____。进行扩增时需先加热至90～95℃，加入引物后冷却至55~60℃，以上调控温度操作的目的分别是_____、_____。

6 . PHB2蛋白具有抑制细胞增殖的作用。为探究PHB2蛋白抑制人宫颈癌细胞增殖的原因，研究者从基因数据库中获取了该蛋白的基因编码序列（简称phb2基因），大小为0.9kb（lkb=1000碱基对），利用乳腺生物反应器来表达该蛋白。回答下列问题：
(1)为获取phb2基因，提取该动物肝脏组织的总RNA，再经________过程得到cDNA，以该cDNA为模板进行PCR扩增phb2基因，PCR需要的条件是________。
(2)制备乳腺生物反应器前，首先将获得的Phb2基因与______等调控元作连接；通常需要在基因两端引入产生不同黏性末端的限制酶切割位点序列再构建出表达载体，这种方案的优点是__________；将构建好的基因表达载体通过__________技术注入到受精卵中，再将受精卵培养成早期胚胎移入受体获得转基因成功的动物。
(3)近来人们尝试制备唾液腺生物反应嚣来代替乳腺生物反应器，与乳腺生物反应器相比其优点是__________（至少两点），结合乳腺生物反应器的制备，简单说明唾液腺生物反应器制备过程________________________。

7 . 基因工程在现代医药卫生领域应用越来越多，下列关于基因工程相关叙述正确的是（       ）

A．基因工程的核心步骤是基因表达载体的构建

B．PCR获得的DNA片段可通过琼脂糖凝胶电泳检测

C．可利用DNA、蛋白质在酒精中的溶解度不同进行分离

D．目的基因是否表达成功可采用抗原．抗体杂交检测

8 . 通过设计引物，运用PCR技术可以实现目的基因的定点诱变。下图为基因工程中获取突变基因的过程，其中引物1序列中含有一个碱基T不能与目的基因片段配对，但不影响引物与模板链的整体配对，反应体系中引物1和引物2的5′端分别设计增加限制酶a和限制酶b的识别位点。下列有关叙述正确的是（　　）

A．在PCR反应体系中还需要加入4种游离脱氧核糖核苷酸、ATP、Taq DNA聚合酶等

B．第3轮PCR结束后，含突变碱基对且两条链等长的DNA占1/4

C．引物中设计两种限制酶识别位点有利于DNA聚合酶识别和结合

D．第2轮PCR，引物2能与图中模板结合并且形成两条链等长的突变基因

9 . 玉米是重要的粮食作物，其叶片细胞中的P蛋白是一种水通道蛋白，由P基因编码，在植物生长发育过程中对水分的吸收具有重要的调节功能。科研人员成功培育出超量表达P蛋白的转基因玉米，回答下列问题。

(1)利用PCR技术以图1中的DNA片段为模板扩增P基因，需要的引物有______（从A、B、C、D四种单链DNA片段中选择）。上述过程中，至少经过______次循环后会产生双链等长的P基因片段，循环4次共需要的引物数为______。
(2)研究人员利用PCR技术获得了P基因，有关该过程的叙述正确的有______

A．需要了解P基因的全部碱基序列

B．新链的合成只能从3′→5′

C．反应体系加入的酶需具有热稳定性

D．G/C含量高的引物在与模板链结合时，复性的温度较高

(3)图2中强启动子是______的结合位点，可驱动基因的表达。在P基因表达过程中，转录所需的原料是______。
(4)培育超量表达P蛋白的转基因玉米过程中所用DNA片段和Ti质粒的酶切位点如图2所示。为使P基因在玉米植株中超量表达，应优先选用______酶组合，理由是____________。
(5)将农杆菌浸泡过的玉米愈伤组织进行植物组织培养，培养基中需加入____________（填“潮霉素”“卡那霉素”或“潮霉素或卡那霉素”）进行筛选，筛选出的愈伤组织经______形成丛芽，最终获得多个转基因玉米株系。
(6)P蛋白在玉米株系的表达量如图3所示，可作为超量表达P蛋白转基因玉米的生理特性研究实验材料的有____________。

10 . 研究表明，哺乳动物体内含有一定量的ω-3多不饱和脂肪酸（ω-3PUFAs）可以起到预防心血管疾病、神经退行性疾病甚至癌症的作用。但ω-3PUFAs在大多数动物体内不能合成，只能从食物中摄取。科研人员从秀丽隐杆线虫中获得控制ω-3PUFAs合成的必需酶基因fat-1，培育转fat-1基因家兔的操作流程如图所示。回答下列问题：
   
(1)利用PCR技术扩增目的基因时，科研人员依据fat-1基因两端的部分核苷酸序列设计了两种引物，还分析了目的基因内部限制酶酶切位点的分布情况，并在两种引物的一端分别加上限制酶_____和_____识别与切割的序列；在设计两种引物时，要求之一是：两种引物之间不能碱基互补配对，理由是_____。
(2)图中所构建的基因表达载体未标注出的必需元件除复制原点外还有_____。
(3)家兔成纤维细胞原代培养过程中，在无菌条件下，取家兔胎儿表面组织块剪碎，用_____酶处理一段时间，使组织分散成单个细胞后移至培养瓶中，置于CO₂培养箱中培养，其中CO₂的主要作用是_____。