1 . 肌肉生长抑制素MSTN是骨骼肌生长发育负调控因子，MSTN在肌肉组织中特异性表达，其活性的丧失或降低会引起动物肌肉的过度发育，表现为肌纤维直径变大或肌纤维数增加，口感良好。因此，通过基因敲除获得具有育种能力的MSTN基因突变牛十分必要。请分析回答下列问题：

限制酶	KpnI	MfeI	HindⅢ	EcoRI	BamHI
识别序列及 切割位点	5′-GGTAC↓C-3′ 3′-C↑CATGG-5′	5′-C↓AATTG-3′ 3′-GTTAA↑C-5′	5′-A↓AGCTT-3′ 3′-TTCGA↑A-5′	5′-G↓AATTC-3′ 3′-CTTAA↑G-5′	5′-G↓GATCC-3′ 3′-CCTAG↑G-5′

(1)科研人员利用打靶载体敲除牛MSTN基因（以下简称M基因），载体构建及M基因敲除过程如图所示。为构建能够敲除M基因的打靶载体，需先设计引物，通过PCR技术扩增M基因。据图应选择的引物是____________（从“a、b、c、d”中选择），将得到的PCR产物酶切后连入打靶空载体，鉴定正确后进行后续实验。引物的作用是____________。
(2)为将抗生素抗性基因neo（抵抗抗生素新霉素）从原载体中切下，随后插入M基因中。据如图及表中限制酶信息，应选择限制酶____________分别对M基因和neo基因进行酶切，并用___________连接，完成打靶载体构建。
(3)将构建好的打靶载体通过____________法导入牛受体细胞中。据图，受体细胞基因组中的M基因通过交换被替换为打靶载体上插入neo基因的M基因片段。交换后的打靶载体以及未成功交换的打靶载体（线形DNA片段）很不稳定，在相关酶的作用下随即降解。
(4)载体可整合到受体细胞基因组DNA的其他部位，引发K基因表达，使细胞在加入物质Q的培养基上无法存活。在选择培养基中除有细胞培养的必需成分外，还需要加入物质Q和____________，可筛选出成功敲除M基因的受体细胞，其原因是____________。

3 . 用A和B两种限制酶同时和分别处理同一DNA片段，限制酶对应切点一定能切开。两种酶切位点及酶切产物电泳分离结果如图1和图2所示。下列叙述错误的是（　　）

A．用A和B两种限制酶同时处理图1中同一DNA片段得到6个游离的磷酸基团

B．图1中X代表的碱基对数为4500，Y是限制酶A的酶切位点

C．电泳凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子大小和构象等有关

D．设计引物从图1中完整DNA片段中扩增出完整X，至少需要1次PCR

4 . 2022年8月，九价HPV疫苗的使用人群扩展到9~45岁适龄女性。研究发现，人类99.7%的宫颈癌是由人乳头瘤病毒（HPV）持续感染引起的。科研人员将HPV病毒表面L1衣壳蛋白基因构建重组质粒，导入大肠杆菌制备HPV疫苗，过程如下图所示。请回答下列问题：

(1)构建重组质粒之前，可利用PCR技术扩增L1基因，此时需要在反应体系中添加的有机物有______、模板DNA、dNTP和引物等，其中引物的作用是______。若在PCR扩增仪中加入1个L1基因，经过30次循环后共消耗引物的数量为______个。
(2)构建重组质粒时应选择的限制酶为______，同时用Ca²⁺处理大肠杆菌使其处于______。重组质粒导入大肠杆菌后，可用添加______的培养基筛选，对长出的单菌落进一步鉴定是否含有L1基因的方法是______。
(3)有人认为，与传统的减毒或灭活疫苗相比，重组疫苗安全性更高，试从疫苗的结构角度推测其这一观点的合理性：______

5 . 宫颈癌是常见的女性恶性肿瘤，宫颈癌的发生主要与人乳头状瘤病毒（HPV）感染有关，其中HPV16、18、31、45型是宫颈癌的高危型。我国研究人员以酿酒酵母菌为表达载体，成功构建表达HPV16型E7蛋白的转基因重组全酿酒酵母疫苗。回答下列问题：
(1)E7蛋白是HPV16型重要的抗原标志蛋白，研究人员首先需要利用PCR技术从HPV16型的基因组中获取E7蛋白的DNA序列，扩增的前提是_____，扩增过程中需要将双链DNA加热至_____进行解链，以_____为原料合成子链。
(2)构建的基因表达载体在E7蛋白基因的尾端还具有终止子，其作用是_____。表达载体中对于目的基因的大量扩增有重要作用的组成部分是_____，该结构在人体内发挥作用时通常需要_____酶。
(3)HPV16型E7蛋白疫苗注入人体后作为抗原，可以刺激机体的B淋巴细胞增殖分化成为_____。在预防接种疫苗时通常需要多次注射，但是相邻的两次注射之间需要间隔一定的时间，原因是_____。

6 . 富平尖柿出饼率高达26%，是制作柿饼的优良品种，被专家誉为“制饼珍品”。柿子鲜果肉中含有可溶性糖、微量元素、维生素和β-胡萝卜素等多种成分，营养价值高，深受消费者的喜爱。柿子的自然脱涩与乙醛代谢关键酶基因（PDC）密切相关，推测涩味程度可能与PDC基因的表达情况有关。已知启动子区域存在着许多调控蛋白的结合位点，RNA聚合酶和调控蛋白共同影响基因的表达水平。AD基因表达出的AD蛋白与启动子足够靠近时，能够激活后续基因转录，据此可利用与AD蛋白形成的融合蛋白来筛选待测蛋白。为筛选PDC基因的调控蛋白，科研人员进行了下列实验。回答下列问题：

(1)PDC基因的启动子序列未知，为获得大量该基因启动子所在片段，可利用限制酶将基因组DNA进行酶切，然后在____的作用下将已知序列信息的接头片段连接在PDC基因的上游，根据接头片段和PDC基因编码序列设计引物进行PCR，引物的作用是____，目前在PCR反应中使用Taq酶而不使用大肠杆菌DNA聚合酶的主要原因是____。
(2)利用质粒A构建含有PDC基因启动子片段的重组质粒并导入代谢缺陷型酵母菌，用不含____的培养基可筛选出成功转化的酵母菌Y1H；将从甜柿中提取的RNA逆转录形成的各种cDNA与质粒G连接后导入酵母菌，此时应选择质粒G中的位点____（填序号1~5）作为cDNA的插入位点，最终获得携带不同cDNA片段的酵母菌群Y187。重组酵母Y1H与Y187能够进行接合生殖，形成的接合子含有两种酵母菌质粒上的所有基因。若接合子能在含有金担子素的培养基中生存，则推测待测蛋白是PDC基因的调控蛋白，请结合图丙简述作出该推测的理由____。

7 . 利用PCR将某小段含目的基因的DNA分子扩增循环n次，下列说法正确的是（　　）

A．延伸的温度必须小于复性温度，且小于变性温度

B．PCR反应过程中需要解旋酶和耐高温的Taq酶

C．共需2n+1-2个引物参与子代DNA分子的合成

D．理论上第4轮循环产物中含两种引物的DNA片段占15/16

8 . 水稻胚乳生物反应器技术是利用基因工程技术改造水稻，以水稻胚乳作为“蛋白生产车间”来表达和生产重组蛋白质或者多肽的技术。血清白蛋白对治疗肝硬化和肝腹水等疾病有显著疗效，我国通过自主研发将血清白蛋白基因导入水稻胚乳细胞，成功提取到植物源重组人血清白蛋白。该技术具有生产成本低、无病原菌的污染以及适合大规模生产等优势。回答下列问题：

(1)根据血清白蛋白氨基酸序列，人工合成血清白蛋白mRNA在___________的催化下获得cDNA，再利用PCR技术扩增得到血清白蛋白基因。PCR反应体系中除含缓冲液、引物外，还应含有___________；引物应选用图中___________（填图中字母）。
(2)为了便于扩增的血清白蛋白基因与质粒连接，经常在两条引物上设计加入不同的限制酶切位点，主要目的是保证___________。
(3)在构建基因表达载体时，需将血清白蛋白基因与___________的启动子等调控组件重组在一起，从而确保血清白蛋白基因在水稻胚乳细胞中表达。
(4)科学家最初利用大肠杆菌生产重组人血清白蛋白，结果没有得到有活性的血清白蛋白，而转基因水稻胚乳细胞能够产生有活性的血清白蛋白。其原因是___________。

9 . 反义基因技术是根据核酸杂交原理设计针对特定靶序列的反义核酸，从而抑制特定基因的表达的技术。为治疗高血压，科学家构建了包含反义AcE基因（血管紧张素基因）的表达载体，取得了较好的降压效果。
(1)构建反义基因表达载体时，需要将AcE基因___（“反向”或“正向”）连接到血管内皮细胞特异性启动子和终止子之间，在受体细胞中表达。试分析其降压作用的原理是___。
(2)利用PCR技术扩增目的基因的前提是___，PCR反应体系中除含有缓冲液、模板DNA、dNTP外，还应含有___。
(3)若要使目的基因在受体细胞中表达，需要通过载体而不能直接将目的基因导入受体细胞，原因是___。
(4)在开展体内实验前，需要将含有反义AcE基因的表达载体导入体外培养的血管内皮细胞，体外培养动物细胞除了提供营养、一定的温度和pH条件外，还需要提供的条件有___。

10 . 现阶段新冠病毒抗原检测试剂盒开始广泛投入使用，各地区也在广泛进行核酸检测。为了探究这两种检测方式的准确性（结果以阳性比例为指标）随感染天数的变化规律，进行了以下实验。请分析回答：
(1)实验思路：选取健康未感染过新冠病毒的小鼠100只，分别标号1~100；并同时进行病毒感染处理，然后____，计算小鼠的抗原检测阳性和核酸检测阳性比例。
(2)实验分析：
①实验原理：
抗原检测方法的原理如下图所示。待检血样加到试纸条一端的样本垫，通过毛细作用向前移动，金标垫上吸附有胶体金（聚集后呈红色）标记的特异性抗原I,若样本中含有病毒特异性抗体，则二者相互作用形成金标记抗原I-抗体复合物，然后继续向前移动，与固定在检测线（T线）的抗原Ⅱ结合而被截留，聚集在检测线上，产生红色条带。游离的金标记抗原I则继续向前到达质量控制区（C线），与此处固定的抗特异性抗原I的抗体（图中简称抗-抗体）结合，从而使C线发生颜色变化。

抗原检测方法的过程中反复进行了____的特异性结合。核酸检测往往是通过咽拭子采集细胞及黏液样本，经一定的处理后得到病毒遗传物质，然后经过____技术进行扩增，通过检测产物量（与荧光强度呈正比）来确定是否为核酸阳性。
②结果分析：
若在____线上出现红色条带，则检测结果为阳性。
(3)实际应用：
与核酸检测相比，抗原检测虽然不够灵敏，但是有____的优点；实际使用中发现，若人体感染了其他病毒，不会造成抗原检测假阳性，原因是____；若某个人从中风险地区回家后，自行进行抗原检测，结果呈阴性，但是防疫部门仍建议居家隔离一段时间，原因是____。