25. 原核生物和真核生物基因组中大片段DNA的定向整合拥有广阔的应用前景。但目前细菌中的定向整合系统存在诸多不足,如整合效率偏低,缺乏有效的筛选标记物,可整合的片段大小有限等。研究者在原有细菌CRISPR/Cas系统基础上尝试构建了CRISPR RNA-guided定向整合系统,以期改善上述缺陷。
(1)Cas蛋白是一种crRNA引导的内切酶,可催化
________(化学键名称)水解,剪切特定双链DNA片段。crRNA是一种短链RNA,它一端可与Cas蛋白结合,另一端通过
________原则与目标DNA序列结合。
(2)转座子(Tn)是一段特殊的DNA片段。转座酶A和转座酶B相互结合后可将Tn从原有的DNA链上切下,并将其整合到其他DNA片段上。为了使转座子定向整合到特定位点,将PCR扩增得到的Cas基因和转座酶A基因形成融合基因,并进一步构建下图所示的CRISPR RNA-guided定向整合系统。
为构建图示的CRISPR RNA-guided系统,需要先设计引物,通过PCR特异性扩增中的Cas基因、转座酶基因等。用于扩增Cas基因的引物需满足的条件是
________。构建时,应将翻译终止序列设置在 Cas基因和转座酶A基因之后而不是设置在两者之间,目的是
________。
(3)研究人员利用一定的方法将获得的CRISPR RNA-guided系统导入大肠杆菌,统计并计算转座子定向整合的效率,结果如下图所示。
①该结果表明,转座子的定向整合效率高低与转座子整合方向密切相关。为保证转座子连接方向与预期相同,构建重组质粒的过程中,对切割转座子和切割载体的限制酶的要求是
________。
②该结果还可表明,CRISPR RNA-guided系统能够有效解决筛选标记物缺乏的问题,依据是
________。