1 . 绍兴腐乳，又叫“霉豆腐”，具有酒醉醇香、细腻松酥、入口即化等特点，是浙江地区的传统名菜。其制作的流程是：让豆腐表面长出毛霉→加盐腌制→加卤汤装瓶→密封腌制。腐乳味道鲜美的主要原因是微生物产生的蛋白酶和脂肪酶等将豆腐中的蛋白质和脂肪等分解成小分子的肽、氨基酸、脂肪酸等，其中的氨基酸与钠盐作用形成氨基酸钠（其中的谷氨酸钠是味精的主要成分）。研究人员欲从自然发酵的传统“霉豆腐”中筛选出新的毛霉菌株以进一步改良风味。
(1)腐乳发酵过程中所用的毛霉菌株是一种____菌。腌制完成后需要加卤汤装瓶，卤汤中酒精的含量一般控制在12%左右，从发酵角度分析主要原因是酒精含量过高，导致_______________；过低，导致杂菌生长，引起变质。
(2)酪素培养基的原理是在培养基中添加酪素，如果菌株能产生蛋白酶并分泌到胞外，则能将酪素降解形成透明圈，从培养基的用途上分，该培养基属于____（填“选择”或“鉴别”）培养基。Hc值是透明圈直径与菌落直径的比值，据Hc值初步筛选出三种具有高蛋白酶活力的菌株编号为M2、M3、M4，原人工接种发酵工艺所用的毛霉菌株编号为M1。将各组毛霉孢子以1：1的比例两两混合，接种于豆腐小块表面，分别以接种__________为对照，培养后测定各组蛋白酶活力和脂肪酶活力如图1所示（柱状图上的误差线“I”代表数据的波动范围）。根据下图1数据，最优的毛霉菌株组合是____。

(3)根据以上研究，研究者想通过以下细胞工程的方案获得M2M3杂种菌株，以期获得优质毛霉菌株。

处理③过程可选择____、离心等物理方法，也可选择合适的化学方法；在此处理前需要先对原生质体2和3进行____。在获得杂种毛霉后，往往还需要经过____和鉴定。结果发现，利用细胞工程得到的杂种毛霉并没有达到预期的效果，其原因可能之一是____。
(4)另一研究小组想通过改造M4菌株形成新的单菌株毛霉发酵工艺，图3为M4菌株改造的基本思路。

图3的流程是利用____工程对毛霉进行改造，A是指活力更高的____（蛋白质）。
若图4为目的基因的部分序列：

现需要在目的基因上游添加EcoRⅠ识别序列（5'-G↓AATTC-3'），下游添加BamHⅠ识别序列（5’-G↓GATCC-3'）以便与载体正确链接，利用PCR扩增目的基因应选择的一对引物是____。

	上游引物	下游引物
A	5'-…GAATTCATGACAGTTAGT…-3'	5'-…GGATCCTCACCGGCAGTA…-3'
B	5'-…GGATCCATGACAGTTAGT…-3'	5'-…GAATTCTCACCGGCAGTA…-3'
C	5'-…GAATTCTACTGTCAATCA…-3'	5'-…GGATCCAGTGGCCGTCAT…-3'
D	5'-…GAATTCAGTGGCCGTCAT…-3'	5'-…GGATCCTACTGTCAATCA…-3'

2 . 科学家运用合成生物学方法构建了一株嗜盐单胞菌H，以糖蜜（甘蔗榨糖后的废弃液，含较多蔗糖）为原料，在实验室发酵生产PHA等新型高附加值可降解材料，期望提高甘蔗的整体利用价值，工艺流程如图所示。回答下列问题：

(1)发酵工程一般包括菌种的选育、扩大培养、培养基的配制、_______、接种、发酵、产品的_______等方面。
(2)三位同学用稀释涂布平板法测定某一时间段内嗜盐单胞菌H的数量，他们的操作及统计结果如下：
甲同学涂布了两个平板，统计的菌落数是236和260，取平均值248；
乙同学涂布了三个平板，统计的菌落数是21、212和256，取平均值163；
丙同学涂布了三个平板，统计的菌落数是209、240和250，取平均值233.
在三位同学的统计中，_________同学的统计是正确的。该方法统计出的结果往往偏低，原因是________。也能使用细菌计数板进行计数，相较前者可以在_______内获得数据。
(3)为获得对蔗糖的耐受能力和利用效率高的菌株H，可将蔗糖作为液体培养基的_____，并不断提高其浓度，多代培养选择。从功能上看，所用培养基为_______。
(4)基于菌株H嗜盐、酸碱耐受能力强等特性，研究人员设计了一种不需要灭菌的发酵系统，其培养基盐浓度设为60g/L，pH为10，菌株H可正常持续发酵60d以上。该系统不需要灭菌，分析原因：一是培养基的盐浓度设为60g/L，其他杂菌因_____而死亡；二是pH为10的条件下，其他杂菌的_____变性失活，生长繁殖受抑制。

4 . 抗虫棉是我国转基因的典型成果之一，其原理是将来自苏云金芽孢杆菌的Bt基因整合到棉花植株中，植物细胞表达合成Bt蛋白，导致敏感昆虫的幼虫吞食后死亡。现利用苏云金芽孢杆菌、农杆菌、棉花植株进行转基因获得抗虫棉。下表为几种限制酶的识别与切割位点。图1、图2中标注了相关限制酶的酶切位点，其中切割位点相同的酶不重复标注。请回答下列问题：

限制酶	BamHⅠ	BclⅠ	Sau3AⅠ	HindⅢ
识别序列及切割位点

(1)目的基因的获取和扩增：从苏云金芽孢杆菌中提取DNA时，通常需要加入EDTA（乙二胺四乙酸二钠）和2mol⋅L^-1的NaCl溶液，作用分别是___和溶解DNA。再从中获得图2所示的DNA片段，并进行PCR扩增，扩增时加入的TaqDNA聚合酶在___阶段发挥作用，加入的dNTP为PCR过程提供___。
(2)形成重组DNA：若选用Sau3AⅠ切图1所示质粒最多可能获得___种与质粒大小相同的线形DNA片段。为了获得由图1质粒和图2目的基因构建的重组质粒，并便于筛选应选用___两种限制酶进行处理。
(3)含重组质粒农杆菌的获得和保存：将分离纯化后的重组质粒与经___处理过的农杆菌混合，进行转化操作。影响转化成功率的因素有___（写出两点）。转化操作后，将菌液接种在含四环素的培养基中进行培养，获得单菌落。从功能上来看，该培养基属于___培养基，理由是___。
(4)组培获得抗虫棉：从冰箱内取出农杆菌，转移至LB全营养培养基中，并在适宜温度条件下使其活化，将其与经___和创伤处理的棉花叶片碎片共同培养，然后进行组培。在组培过程中，培养基中的蔗糖起着作为碳源提供能量和___的双重作用。可利用___（答出两点）等技术从分子水平检验是否获得转Bt基因植物。

5 . 下列关于产纤维素酶菌分离及运用的叙述，不合理的是（       ）

A．筛选培养基中应含有大量的葡萄糖或蔗糖提供碳源

B．可从富含腐殖质的林下土壤中筛选产纤维素酶菌

C．在分离平板上长出的菌落需进一步确定其产纤维素酶的能力

D．用产纤维素酶菌发酵处理农作物秸秆可提高其饲用价值

6 . 为建设社会主义新农村，解决农村生产生活垃圾处理的问题，某办事处给出了处理方案：
(1)某团队从土壤中筛选出降解玉米秸秆的复合菌的过程中，用高压蒸汽灭菌法对培养基进行灭菌，灭菌从___开始计时；全部工作结束后，为了不污染环境，所有使用过的器皿、废弃物都必须进行___处理后再洗涤倾倒。
(2)若要筛选出能分解包装塑料的细菌应使用___培养基（从功能角度回答）。
(3)调查小组为了从被污染的湖水中分离获得能降解环境污染物M（一种含有C、H、O、N的有机物）的细菌的单菌落，设计了甲、乙两种培养基（成分见下表）：

成分	无机盐	淀粉	M	琼脂糖	水
培养基甲	+	+	+	-	+
培养基乙	+	+	+	+	+

①据表判断，其中成分M主要是作为___起作用，培养基___（填“甲”或“乙”）可用于分离能降解M的目的菌。
②如何判断该培养基有无杂菌污染___（请回答出判断方法和结果）。
③在接种时选用___法接种，可以计数细菌的增殖情况；接种前需用无菌水对菌液进行___，得到稀释倍数为10⁵的土壤样品；在3个细菌培养基平板上，均接种稀释倍数为10⁵的土壤样品溶液0.1mL，培养一段时间后，平板上长出的细菌菌落数分别为156、178和191。1mL原土壤样液中的细菌数量为___个。

7 . 酵母菌是一种单细胞真菌，能将糖发酵成酒精和二氧化碳，分布于整个自然界，是一种天然发酵剂。在生活中人们常用茶酵母、面包酵母和啤酒酵母来制作食品。
资料1：《书经》中的“若作酒醴，尔惟曲蘖”提到酿酒必须要用酒曲。酒曲是以谷物为原料，破碎加水压制而成的。酒曲富含酵母菌和霉菌等多种微生物，经水浸泡活化后投入蒸熟的米即可用于酿酒。
资料2：酵母菌细胞壁的主要成分是几丁质。酿酒酵母产酒精能力强，但没有合成淀粉酶的能力；糖化酵母能合成淀粉酶，但酒精发酵能力弱。为了实现以谷物为原料高效生产酒精的目的，科研人员进行了酵母菌种的改良实验。阅读材料完成下列小题：
1．下列叙述错误的是（       ）

A．夏季气温升高，需用沸水浸泡酒曲以防杂菌污染

B．夏酒曲中霉菌分泌的蛋白酶可将蛋白质分解为小分子肽和氨基酸

C．酒曲经水浸泡活化有利于提高酶的活性和酵母菌的代谢

D．酿酒过程中，应适时放气

2．下图为资料2中提到的改良酵母菌种的实验。请据图分析，下列叙述正确的是（       ）

A．用PEG诱导之前需用纤维素酶去除两种酵母的细胞壁

B．以淀粉转化为还原糖的效率作为最终鉴定目的菌的指标

C．在培养基X中以淀粉为唯一碳源即可筛选出杂种酵母

D．以谷物为原料用酿酒酵母酿酒时，需对原料进行糖化处理

9 . 营养缺陷型菌株是突变后某些酶被破坏，导致代谢过程中某些合成反应不能进行的菌株。下图是科研人员利用影印法（用无菌绒布轻盖在已长好菌落的原培养基上，然后不转动任何角度，“复印”至新的培养基上）初检组氨酸缺陷型菌株的过程。下列叙述正确的是（       ）

   

A．①过程接种方法为平板划线法，接种后的培养皿进行倒置培养

B．过程②的基本培养基与完全培养基区别是基本培养基有组氨酸

C．进行过程②培养时必须先将丝绒布转印至完全培养基上再转印到基本培养基上

D．氨基酸缺陷型菌株应从基本培养基上没有而完全培养基上对应位置有的菌落中挑选

10 . 下列关于“能分解尿素的微生物的分离与计数”实验的叙述，错误的是（       ）

A．用无菌的G6玻璃砂漏斗在超净工作台中对尿素固体培养基进行过滤除菌

B．从有哺乳动物排泄物的地方取土样，分离到目的微生物的概率高

C．培养过程中，将培养皿倒置能防止杂菌的污染

D．在相同培养条件下，圆形红色区域愈大，表明这种菌利用尿素的能力愈强