1 . 日常生活中产生的厨余垃圾含有大量有机物，极易腐败发酸发臭、滋生有害生物，若收集转运过程中发生泄漏则会污染空气、土壤及水源。科研人员从绿色木霉中获得了纤维素内切葡聚糖酶基因EGⅢ，并将其导入毕赤酵母中，构建出了基因工程菌（流程如图所示），实现了高效降解厨余垃圾中纤维素的目的。请据图回答下列问题。
   
注：图中BamHⅠ、ECoRⅠ、SalⅠ为限制酶
(1)限制酶能够识别__________，并且使每一条链中特定部位的__________断开。为了构建基因表达载体，应该选择__________（限制酶）切割目的基因和质粒DNA，判断的依据是__________。完整的基因表达载体包括__________。
(2)将目的基因导入大肠杆菌后，需在培养基上培养，培养基需用__________法进行灭菌，培养皿用__________法进行灭菌。
(3)毕赤酵母能够表达出纤维素内切葡聚糖酶，转化才算成功，请设计实验检验转化是否成功__________。

2 . 某科研所从腐烂的葡萄皮及醋醅、葡萄汁、自酿葡萄酒中筛选出一株性能优良的醋酸菌M12，其分离纯化步骤如下：
样品→富集培养→分离纯化→定性实验→定量实验→菌种鉴定。
请回答下列问题：
(1)从腐烂的葡萄皮及醋醅、葡萄汁、自酿葡萄酒中筛选出醋酸菌，其依据是____。
(2)醋酸菌的代谢类型是____，其呼吸的场所是____，发酵时需要将温度控制在____℃。
(3)分离培养醋酸菌M12时必须进行无菌操作，包括培养基和各种器皿都必须是无菌的，常用的灭菌方法有____（至少答两种）。
(4)某同学尝试用从超市买来的食醋中分离醋酸菌，结果没有得到任何菌落，原因是____。
(5)培养醋酸菌时在培养基中加入95%的酒精，其作用是____。为测试M12的耐酒精能力，请简要说明实验设计的思路：____。

3 . 臭鳜鱼是利用新鲜鳜鱼为原料，配以食盐、花椒等辅料，由乳酸菌等多种微生物共同发酵制得的鱼制品。科研人员利用MRS-溴甲酚绿培养基（配方如表），从传统臭鳜鱼中分离筛选到一株乳酸菌，并研究其对多种微生物的抑菌能力。请回答下列问题：

物质	含量
胰蛋白胨	10g/L
牛肉膏	10g/L
酵母粉	10g/L
番茄汁	200g/L
葡萄糖	10g/L
碳酸钙	20g/L
溴甲酚绿	0.1g/L
琼脂	18g/L

注明：乳酸能与碳酸钙反应出现溶钙圈；溴甲酚绿为pH显色剂，酸性显示黄色、碱性显示蓝绿色。
(1)科研人员在无菌条件下，取臭鳜鱼鱼肉打成鱼糜，将其稀释至适当浓度，在MRS-溴甲酚绿平板上划线，在温度适宜且__________（填“有氧”或“无氧”）的环境下倒置培养48h。挑取平板上__________的菌落进行重复划线培养，直至菌株纯化。
(2)用试剂盒提取该菌株的基因组DNA并以此为模板，加入__________等对菌株的16SrDNA序列进行定向扩增以确定该菌株的类型，常用__________来鉴定PCR的产物。
(3)为了检测该株乳酸菌代谢产物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、腐生葡萄球菌、丁香假单胞菌四种病原菌的抑制效果，科研人员将分别含有四种病原菌的培养基倒入A～D四个培养皿中，并使每个培养基上形成4个大小相同的小孔，标号为1～4。向1号孔中加入__________作为对照，向2～4号孔中分别加入100μL含有该株乳酸菌代谢产物的液体培养基，在适宜条件下静置培养24h，测量抑菌圈的直径，结果如图：

根据实验结果可以得出的结论是____________________。

4 . 人体内的t-PA蛋白能高效降解由纤维蛋白凝聚成的血栓，是心梗和脑血栓的急救药。
(1)研究人员采用PCR技术可以获得大量t-PA基因，PCR的原理是_____，此外，大量获得t-PA基因的方法还有____（答出1种）。
(2)研究表明，为心梗患者注射大量t-PA会诱发颅内出血，其原因在于t-PA与纤维蛋白结合的特异性不高，若将t-PA第84位的半胱氨酸换成丝氨酸，能显著降低出血副作用。据此，先对天然的t-PA基因进行序列改造，然后再采取传统的基因工程方法表达该改造后的基因，可制造出性能优异的改良t-PA蛋白。（注：如图表示相关的目的基因、载体及限制酶。pCLY11为质粒，新霉素为抗生素。）请回答下列问题：
   
①为获得t-PA改良基因，要用到_____技术来进行碱基的替换。若获得的t-PA改良基因如图所示，那么质粒pCLyll需要用限制酶____和____切开，才能与t-PA改良基因高效连接。
②将连接好的DNA分子导入大肠杆菌中对大肠杆菌接种培养，在培养基中除了加入水、碳源、氮源等营养物之外，还应加入_____进行选择培养，以筛选成功导入pCLy11的细菌。配置好的培养基，通常采用____方法进行灭菌。
③对培养得到的菌落进行筛选，其中菌落为____色的即为含t-PA改良基因的重组DNA分子的大肠杆菌。

5 . 温泉中含有能够分解淀粉的耐热古细菌，在固体培养基中，该类细菌分解淀粉会形成透明圈。如图表示筛选能高效产生淀粉酶的耐热古细菌的过程，下列分析正确的是（       ）

   

A．②过程是利用稀释涂布平板法分离并筛选耐热古细菌

B．配制Ⅰ号培养基时需要加入琼脂，需要调节pH<7

C．为防止杂菌污染需要对I、Ⅱ号培养基及培养皿进行干热灭菌

D．从I号培养基中选择透明圈最小的菌落接种到Ⅱ号培养基

6 . 牛奶中富含蛋白质，长期饮用有助于增强体质，但牛奶同时也是多种疾病的传播载体。国家标准是每毫升牛奶中细菌数小于30000个，下图是牛奶消毒及细菌检测实验的简要操作流程。回答下列问题：
   
(1)图中步骤①采用的消毒方法是____,该消毒方法的优点是____。
(2)进行步骤③操作的培养基中，牛肉膏、蛋白胨可以为微生物提供碳源、氮源外还有可能为微生物提供___等该步骤应选用的接种方法是____,如果接种后经培养的多个平板培养基上有一个培养基未出现菌落，从操作层面分析，最可能的原因是____。
(3)将接种后的培养基和作为对照的____倒置，同时放入37℃恒温培养箱中，培养36小时后可观察到菌落，可以根据菌落的特征来判断微生物的类群，推测菌落的特征可能有菌落的____(答出1项即可)。
(4)培养36小时后可观察到菌落，取出统计各平板的菌落数，结果如下表所示。

牛奶稀释倍数	102	103	104
平板1菌落数	78	10	1
平板2菌落数	102	12	1
平板3菌落数	90	10	0

由实验结果可推知，应该选择其中稀释倍数为___ 的平板进行计数；经过此种方法消毒后，每毫升牛奶中细菌数大约____ 个。

7 . 厨余垃圾中有机质含量高，利用微生物发酵技术将厨余垃圾变成绿色有机肥，可有效实现厨余垃圾无害化和资源化处理。某实验小组欲从厨余垃圾中筛选能高效降解淀粉的细菌，实验操作流程如图所示。回答下列问题：
   
(1)实验过程中对培养皿、烧杯等玻璃仪器常用_________法进行灭菌。在接种前，需要对厨余垃圾浸出液进行_________处理。
(2)在配制X培养基的组成成分时，加入的唯一碳源是淀粉，目的是___________。经检测③菌落为硝化细菌，③菌落能在此培养基上生长但没有形成透明圈的原因是____________。
(3)用来筛选淀粉分解菌的X、Y培养基含有KH₂PO₄和Na₂HPO₄，其作用有______________（答出2点）。
(4)若厨余垃圾中混入了抗生素，将不利于其生物降解，为了筛选出对抗生素有抗性、能高效降解淀粉的细菌，在上图所示的基础上，对实验操作的优化方案是______________。

9 . 下图为某微生物的实验室培养和纯化过程中的部分步骤，下列说法正确的是（       ）

   

A．步骤①使用的培养基需要充分冷却

B．步骤②接种环经灼烧灭菌后应趁热快速蘸取菌液

C．③到④过程中，每次划线前都需要对接种环进行灼烧灭菌

D．完成平板划线后需要立即将平板倒置，放入恒温培养箱中培养