1 . 锌转运蛋白在某种植物根部细胞特异性表达并定位于细胞质膜，具有吸收和转运环境中Zn²⁺的功能。为研究该植物2种锌转运蛋白M和N与吸收Zn²⁺相关的生物学功能，在克隆M、N基因基础上，转化锌吸收缺陷型酵母，并进行细胞学鉴定。回答下列问题：
(1)锌转运蛋白基因M、N克隆。以该植物______为材料提取并纯化mRNA，反转录合成cDNA。根据序列信息设计引物进行PCR扩增，PCR每个循环第一步是进行热变性处理，该处理的效果类似于生物体内______的作用效果。PCR产物琼脂糖凝胶电泳时，DNA分子因为含______而带负电荷，凝胶点样孔端应靠近电泳槽负极接口；当2个PCR产物分子量接近时，若延长电泳时间，凝胶中这2个条带之间的距离会______。回收DNA片段，连接至克隆载体，转化大肠杆菌，测序验证。
(2)重组表达载体构建。分别将含M、N基因的重组质粒和酵母表达载体同时进行双酶切处理，然后利用______连接，将得到的重组表达载体转化大肠杆菌。用PCR快速验证重组转化是否成功。此反应可以用大肠杆菌悬液当模板的原因是______。
(3)酵母菌转化。取冻存的锌吸收缺陷型酵母菌株，直接在固体培养基进行______培养，活化后接种至液体培养基，采用______以扩大菌体数量，用重组表达载体转化酵母菌。检测M、N基因在受体细胞中的表达水平，无显著差异。
(4)转基因酵母功能鉴定。分别将转化了M、N基因的酵母菌株于液体培养基中培养至OD₆₀₀为0.6。将菌液用______法逐级稀释至OD₆₀₀为0.06、0.006和0.0006，然后各取10μL菌液用涂布器均匀涂布在固体培养基上，培养2天，菌落生长如图。该实验中阴性对照为______。由实验结果可初步推测：转运蛋白M和N中，转运Zn²⁺能力更强的是______，依据是______。

注：OD600为波长600nm下的吸光值，该值越大，菌液浓度越高；空载体为未插入M或N基因的表达载体。

2 . 为了将某纳米抗体和绿色荧光蛋白基因融合表达，运用重组酶技术构建质粒，如图1所示。请回答下列问题：

   

(1)分别进行PCR扩增片段F1与片段F2时，配制的两个反应体系中不同的有______，扩增程序中最主要的不同是______。
(2)有关基因序列如图2．引物F2-F、F1-R应在下列选项中选用______。
   

A．ATGGTG------CAACCA

B．TGGTTG------CACCAT

C．GACGAG------CTGCAG

D．CTGCAG------CTCGTC’

(3)将PCR产物片段与线性质粒载体混合后，在重组酶作用下可形成环化质粒，直接用于转化细菌。这一过程与传统重组质粒构建过程相比，无需使用的酶主要有_______。
(4)转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选，下列叙述错误的有_______。

A．稀释涂布平板需控制每个平板30~300个菌落

B．抗性平板上未长出菌落的原因一般是培养基温度太高

C．抗性平板上常常会出现大量杂菌形成的菌落

D．抗性平板上长出的单菌落无需进一步划线纯化

(5)为了验证平板上菌落中的质粒是否符合设计，用不同菌落的质粒为模板，用引物F1-F和F2-R进行了PCR扩增，质粒P1~P4的扩增产物电泳结果如图3．根据图中结果判断，可以舍弃的质粒有______。

   

(6)对于PCR产物电泳结果符合预期的质粒，通常需进一步通过基因测序确认，原因是______。

3 . 自然界中不同微生物之间存在着复杂的相互作用。有些细菌具有溶菌特性，能够破坏其他细菌的结构使细胞内容物释出。科学家试图从某湖泊水样中分离出有溶菌特性的细菌。
(1)用于分离细菌的固体培养基包含水、葡萄糖、蛋白胨和琼脂等成分，其中蛋白胨主要为细菌提供___________和维生素等。
(2)A菌通常被用做溶菌对象。研究者将含有一定浓度A菌的少量培养基倾倒在固体培养平板上，凝固形成薄层。培养一段时间后，薄层变浑浊（如图），表明______________________。

(3)为分离出具有溶菌作用的细菌，需要合适的菌落密度，因此应将含菌量较高的湖泊水样___________后，依次分别涂布于不同的浑浊薄层上。培养一段时间后，能溶解A菌的菌落周围会出现___________。采用这种方法，研究者分离、培养并鉴定出P菌。
(4)为探究P菌溶解破坏A菌的方式，请提出一个假设，该假设能用以下材料和设备加以验证（主要实验材料和设备：P菌、A菌、培养基、圆形滤纸小片、离心机和细菌培养箱）___________。

4 . 回答下列（一）、（二）小题：
（一）回答与甘蔗醋制作有关的问题：
（1）为了获得酿造甘蔗醋的高产菌株，以自然发酵的甘蔗渣为材料进行筛选。首先配制醋酸菌选择培养基：将适量的葡萄糖、KH₂PO₄、MgSO₄溶解并定容，调节pH，再高压蒸汽灭菌，经__________后加入3%体积的无水乙醇。然后将10 g自然发酵的甘蔗渣加入选择培养基，振荡培养24 h。用__________将少量上述培养液涂布到含CaCO₃的分离培养基上，在30 ℃培养48h。再挑取分离培养基上具有__________的单菌落若干，分别接种到与分离培养基成分相同的__________培养基上培养24 h后，置于4 ℃冰箱中保存。
（2）优良产酸菌种筛选。将冰箱保存的菌种分别接入选择培养基，培养一段时间后，取合适接种量的菌液在30 ℃、150 r/min 条件下振荡培养。持续培养至培养液中醋酸浓度不再上升，或者培养液中______含量达到最低时，发酵结束。筛选得到的优良菌种除了产酸量高外，还应有____________________（答出2点即可）等特点。
（3）制醋过程中，可将甘蔗渣制作成固定化介质，经_________后用于发酵。其固定化方法为_________。
（二）斑马鱼是一种模式动物，体外受精发育，胚胎透明、便于观察，可用于水质监测，基因功能分析以及药物毒性与安全性评价等。
（1）由于人类活动产生的生活污水日益增多，大量未经处理的污水直接排入河流、湖泊会引起水体__________，导致藻类大量繁殖形成水华。取水样喂养斑马鱼，可用斑马鱼每周的体重和死亡率等指标监测水体污染程度。
（2）为了研究某基因在斑马鱼血管发育过程中的分子调控机制，用 DNA 连接酶将该基因连接到质粒载体形成_______，导入到大肠杆菌菌株 DH5α 中。为了能够连接上该目的基因、并有利于获得含该目的基因的 DH5α 阳性细胞克隆，质粒载体应含有__________（答出2点即可）。提取质粒后，采用____法，将该基因导入到斑马鱼受精卵细胞中，培养并观察转基因斑马鱼胚胎血管的发育情况。
（3）为了获取大量斑马鱼胚胎细胞用于药物筛选，可用__________分散斑马鱼囊胚的内细胞团，取分散细胞作为初始材料进行__________培养。培养瓶中添加成纤维细胞作为__________，以提高斑马鱼胚胎细胞克隆的形成率。