21. 灵芝是一种历史悠久的名贵食药用真菌,具有抗肿瘤、抗氧化、保肝解毒、改善造血机能和免疫调节等重要药理功能。荧光蛋白被广泛应用于分子生物学研究中。通过基因工程可实现黄色荧光蛋白(yfp)在灵芝中的稳定表达。操作步骤如下:
①人工合成包含限制酶Nhe Ⅰ和Sma Ⅰ识别位点的yfp基因(844bp)DNA片段,限制酶的识别序列和切割位点如图1。
②构建PJW-EXP-yfp表达载体(如图2)。
③将表达载体转入灵芝原生质体中,在选择培养基上筛选受体菌。
④对筛选得到的受体菌株进行PCR扩增鉴定,结果如图3。
⑤在荧光显微镜明场(DIC)下能观察到灵芝菌丝发黄色荧光,说明获得了稳定导入yfp的工程菌株。
根据以上信息回答下列问题:
(1)除了人工合成目的基因外,还可以用什么方法得到目的基因:
________。
(2)目的基因与PJW-EXP载体皆被Nhe Ⅰ和Sma Ⅰ切割后,只需加入一种
________(填“T4”或“E.coli”)DNA连接酶可完成拼接得到重组表达质粒。
(3)为了筛选出成功导入重组质粒的灵芝细胞(转化菌株),培养基中除了加入细胞生长的必备物质外,还需加入
________。
(4)上述操作中PCR成功扩增出了包含内源性启动子Pgpd(甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因启动子)和yfp的DNA片段,从电泳结果可知Pgpd启动子的碱基长度为
________bp。
(5)科学家在对纤维二糖水解酶Ⅱ基因诱导型启动子(Pcbh2)进行活性分析时,发现以纤维素为碳源时能诱导启动子Pcbh2的活性,而葡萄糖无法诱导。若要通过基因工程利用黄色荧光蛋白证明该结论,以下实验材料必备的是
________。
①纤维素②葡萄糖③纤维素+葡萄糖④野生型菌株⑤导入Pgdp和yfp的菌株⑥导入Pcbh2和yfp的菌株
若实验成功,实验结果应为
______________________________。