1 . 大肠杆菌能进入实体瘤核心并保持较强活性，科研人员期望利用大肠杆菌构建一种基因表达可控的工程菌，期望用于人体特定部位实体瘤的免疫治疗。
(1)科研人员利用温度敏感型转录调控蛋白构建温控表达的质粒系统，如下图。

   

①利用来自λ噬菌体的温度敏感型转录抑制因子Tcl42作为“开关”构建温控抑制元件，在___（选填“λ噬菌体”、“大肠杆菌”或“人”）中具强活性的启动子pLac可以使Tcl42持续性表达，抑制启动子pRL；当控温至42℃时才开启特定基因的表达。
②Tcl42开关仅在加热时瞬时激活特定基因，而免疫疗法需要数周才能见效，所以设计了“基因电路”（一次短暂的温度激活后可维持长期的基因表达），其核心基因包括重组酶Bxb1基因、分泌型αPD-L1蛋白基因（该蛋白可用免疫治疗）等。
请选择相关选项完善该“基因电路”的技术路线：
___及质粒，获基因电路→受体菌37℃时，蛋白Tcl42抑制启动子pRL→___→免疫元件无功能（不表达aPD-L1）→___→解除蛋白Tcl42对启动子pRL的抑制→___→___→细菌合成GFP，并分泌大量αPD-L1。
A．重组酶Bxb1基因不表达
B．菌体升温至42℃时
C．用不同的限制酶、DNA连接酶分别处理温控抑制元件、重组元件、免疫元件
D．启动子p7启动荧光蛋白GFP基因、αPD-L1基因的转录
E．重组酶Bxb1基因表达，进而引起启动子p7两侧发生重组
(2)科研人员用___处理大肠杆菌，使其处于感受态，从而将“基因电路”质粒导入菌体内，在37℃条件下培养、涂布后，筛选___（选项），由此成功构建用于免疫治疗的温控工程菌（EcT）。
A．含有四环素的培养基上形成的菌落
B．具有绿色荧光的菌落
C．同时具有A和B特征的菌落
D．具有A或B特征的菌落均可
(3)使用聚焦超声（FUS）装置，可以使动物特定范围的组织快速升温至42℃，从而实现体内微生物治疗的温度控制。为验证上述温控工程菌的治疗肿瘤效果，选取若干组生理状态相近的小鼠，经过7天的成瘤建模后，分别进行如下处理，并检测记录小鼠体内肿瘤体积。
第1组：注射生理盐水，2天后FUS处理；
第2组：注射温控工程菌，2天后FUS处理。为了排除改造后的温控工程菌在未热激活状态对肿瘤生长的影响请增设对照组___。

2 . 黏多糖贮积症是由IDUA基因突变导致的遗传病。黏多糖贮积症患者细胞中IDUA基因转录出的mRNA 长度不变但提前出现终止密码子，最终导致合成的 IDUA酶失去活性，引发黏多糖积累过多而无法及时清除，造成人体多系统功能障碍。
(1)造成IDUA 基因突变的原因是由于碱基对____。（选填编号）
①缺失     ②增添     ③替换
(2)异常IDUA 酶与正常IDUA 酶的差异体现在____。（选填编号）
①氨基酸的数目不同     ②活性中心结构不同     ③催化的底物种类不同
抑制性tRNA（sup-tRNA）的反密码子可以与终止密码子配对。在IDUA 突变基因的翻译过程中，加入 sup-tRNA 可获得有功能的全长蛋白。
(3)抑制性tRNA 的功能是____。

A．使翻译提前终止

B．抑制氨基酸脱水缩合

C．改变 mRNA 的序列

D．使终止密码子编码氨基酸

不同的sup-tRNA可以携带不同氨基酸。科研人员将不同的sup-tRNA导入实验动物体内，并检测了IDUA 蛋白的分子量（条带的粗细可以反映分子量的大小），结果如表，其中“-”代表未加入。

sup-tRNA 携带的氨基酸种类	对照组	实验组（黏多糖贮积症个体）
	-	-	色氨酸	酪氨酸	丝氨酸	亮氨酸	赖氨酸	谷氨酸
全长 IDUA 蛋白

(4)据表分析， 可继续探究用于治疗的 sup-tRNA携带的氨基酸是____（选填编号）
①色氨酸②酪氨酸 ③丝氨酸 ④亮氨酸 ⑤赖氨酸 ⑥谷氨酸
(5)科研人员利用选定的 sup-tRNA 对IDUA 突变基因纯合小鼠及 IDUA 基因敲除小鼠进行治疗，检测肝脏细胞IDUA酶活性和组织黏多糖的积累量。与不治疗的小鼠相比较，下列预期的实验结果中，可说明治疗有效的是____。

A．IDUA突变基因纯合小鼠IDUA酶活性高，组织黏多糖积累量少

B．IDUA 基因敲除小鼠IDUA酶活性与组织黏多糖积累量无明显差异

C．IDUA 基因敲除小鼠 IDUA酶活性高， 组织黏多糖积累量少

D．IDUA 突变基因纯合小鼠IDUA酶活性与组织黏多糖积累量无明显差异

人类最常见的半乳糖血症是由半乳糖-1-磷酸尿苷转移酶（GALT） 缺乏而引起的一种遗传病，控制该酶合成的基因（用B、b表示）位于第9号染色体短臂pl3区。在一般人群中， 约每150人中有1人为该病基因的携带者。杂合子一般不发病，但其GALT活性仅为正常人的50%。某正常男子（甲）有一个患病哥哥和患病妹妹（乙），父母均正常。据调查：甲的父母是姑表亲，在该家族近五代中也出现过其他患者，但在五代以前从未出现该病患者和GALT活性较低的人。请根据信息回答问题：
(6)半乳糖血症是一种____（填选项中的字母）遗传病。造成该家族患此遗传病的根本原因是____。
A．常染色体显性          B．常染色体隐性
C．伴 X染色体显性     D．伴 X染色体隐性
(7)甲的父母所生子女患病的概率是____。若甲的父亲当初与无血缘关系的正常女性婚配，后代患病的概率是____。由于有血缘关系的近亲中含有从L代遗传下来的____概率高，近亲婚配可导致后代遗传病发病率明显高于正常人。因此，我国婚姻法规定禁止____结婚。
半乳糖血症是一种半乳糖代谢异常的疾病，半乳糖代谢的大致过程如图所示。

(8)半乳糖激酶（GALK）的基因位于17号染色体q21-22区，在隐性纯合（a）时， GALK无法合成。若检测甲的血浆， 推测其半乳糖-1-磷酸浓度高于正常人。但却低于乙的概率是____；在乙的血浆中检测出虽然半乳糖-1-磷酸浓度较高，但半乳糖浓度不高，推测她的基因型可能是____。过多的半乳糖-1-磷酸堆积于脑、肝、肾小管等组织中，会引起这些器官损害。从基因、蛋白质与性状的关系分析，GALK、GALT基因通过____，进而控制性状。
S基因参与减数分裂过程， 与雄性动物少精子症和无精子症相关，研究人员围绕S基因展开了系列实验。
(9)在减数分裂过程中，染色体只____一次，而细胞连续分裂两次，结果导致____。早期精母细胞处于减数分裂I前期，其重要特征是____。该时期可依次划分为细线期、偶线期、粗线期、双线期和终变期五个亚时期。
雄性小鼠出生第10天可启动减数分裂。收集出生后10~18天小鼠睾丸制作切片并染色，观察野生小鼠（WT）与S基因敲除小鼠（KO）的生精小管横切结构，结果如图1；统计18d两组小鼠睾丸中早期精母细胞各期比例，结果如图2

(10)据图1可知，____d时两组小鼠的生精小管中均出现了染色质浓缩的早期精母细胞；但随着时间推移，WT的管壁精母细胞层数____、形态规则且排列整齐，KO的管壁精母细胞____：据图2可知，S基因缺失导致精子的发生被阻滞于减数分裂1的____。
己有研究表明多个基因（R、P、E、C）参与精子发生的调控，为进一步探究S基因的作用机制，研究人员检测了WT和KO睾丸中相应蛋白的表达情况，结果如图3。

(11)图3中β-Actin蛋白的作用____。
(12)据图3可知，与S基因发挥作用有关的是 R 基因和E基因，判断依据是____。
(13)基于以上研究， 请提出一个可进一步研究的方向：____。

3 . CRISPR-Cas系统包含CRISPR基因和Cas基因（CRISPR关联基因）两部分，其中CRISPR是细菌等原核生物基因组内的一段重复序列，当病毒入侵后，某些细菌能够把病毒基因的一小段存储到 CRISPR，Cas基因则位于CRISPR基因附近或分散于基因组其他地方，该基因编码的蛋白均可与CRISPR序列区域共同发生作用，CRISPR-Cas系统的组成如下图所示，现在CRISPR-Cas9（由一条单链向导RNA和内切核酸酶Cas9组成）已发展成为对靶向基因进行特定修饰的第三代基因编辑技术。回答下列有关问题：

(1)CRISPR-Cas系统的形成是细菌与病毒_____________的结果，在CRISPR-Cas系统中，前导区作为启动子，是______________识别和结合的部位，能驱动__________________基因的表达过程。
(2)CRISPR—Cas系统中，间隔区应是_______，该系统在细菌中的作用是____________。
(3)CRISPR—Cas9基因编辑技术取代早期基因工程的原因是____________________，根据其组成成分推测其工作的原理并简要叙述_______________。

4 . 光合生物吸收过量光能会引起光抑制，即光合作用最大效率和速率降低。下图1为叶肉细胞进行光反应过程的模式图，PSII反应中心是光抑制发生的主要部位。光合生物进化出了多种光保护机制，光呼吸途径是一种重要的途径，其过程如下图2，请回答下列问题。

   

(1)图1中PSII和PSI是由光合色素和蛋白质组成的复合物，位于叶绿体的_______。自然界中某些细菌如硫细菌进行光合作用时不产生氧气，推测此类细菌可能不具_______（填“PSI”或“PSII”）。据图可知，ATP合酶合成ATP直接动力是_______，光反应生成的ATP和NADPH为暗反应提供了_______。
(2)强光照射往往会使环境温度升高，导致_______，CO₂供应不足，暗反应减慢，光反应产物ATP、NADPH在细胞中的含量_______。由于NADP⁺不足，导致电子积累，产生大量的活性氧，这些活性氧攻击叶绿素和PSII反应中心，从而损伤光合结构。
(3)图2中Rubisco是一种双功能酶，在光下它催化RuBP（C₅）与CO₂的反应称为_______，还能催化C₅与O₂反应产生CO₂进行光呼吸。强光下，光呼吸增强，产生的C₃和CO₂可加快暗反应的进行，消耗NADPH增多，减缓_______的不足，避免电子积累引起的光合结构损伤。
(4)科研人员发现植物细胞内的呼吸链中存在由交替氧化酶（AOX）主导的交替呼吸途径，对植物抵抗强光也具有重要意义。下图表示ATP与呼吸链对光合作用相关反应的影响。

   

强光环境下，植物细胞通过“草酰乙酸/苹果酸穿梭”途径，可有效地将光照产生的_______中的还原能输出叶绿体，并最终在_______（填场所）通过AOX的作用将其中大部分能量以_______形式散失，从而有效缓解强光对植物细胞内光系统的损伤。

6 . 叶绿体中的Rubisco酶是光合作用的关键酶。CO₂和O₂竞争与其结合，分别催化C₅的羧化与氧化。C₅羧化是固定CO₂合成糖；C₅氧化则产生乙醇酸，乙醇酸离开叶绿体在其他细胞器中转变为乙醛酸，乙醛酸经过转氨基作用形成甘氨酸，甘氨酸再经一系列反应释放CO₂，同时转变为C₃重新进入卡尔文循环，该过程称为光呼吸。

科学家将拟南芥酶A基因突变体(酶A功能丧失)和野生型分别在大气CO₂浓度和高CO₂浓度(3500 ppm)下培养一段时间后，叶片内乙醛酸含量如下图1。

(1)提取拟南芥中的Rubisco酶时，为了保持该酶的活性，研磨时应加入_______(填“无水乙醇”或“磷酸缓冲液”)，Rubisco 酶分布在叶绿体的________。
(2)若利用提纯的Rubisco等酶模拟光合作用暗反应过程，构建反应体系时需要加入的供能物质有________________。
(3)与高CO₂浓度相比，突变体在大气CO₂浓度下的乙醛酸含量高的原因有_____。

A．C5氧化反应产生乙醇酸加强

B．乙醇酸转变为乙醛酸加强

C．乙醛酸转氨基作用形成甘氨酸加强

D．甘氨酸经一系列反应释放CO2加强

(4)根据图1结合光呼吸过程推测酶A的功能是_________________。
(5)研究小组测得在适宜条件下野生型叶片遮光前吸收CO₂的速率和完全遮光后释放CO₂的速率如图，则光呼吸释放CO₂的量可以用________的面积表示。

8 . 枯草芽孢杆菌所产生的透明质酸是一种应用广泛的粘性多糖，研究者欲改造枯草芽孢杆菌，通过添加诱导型启动子来协调菌体生长与产物生产之间的关系。
(1)为通过外源添加诱导剂来控制基因的表达，研究者选择了含木糖诱导型启动子的p质粒，其中EcoRV酶切位点的识别序列为5'-GATATC-3'，Xbal酶切位点的识别序列为5'-TCTAGA-3'。透明质酸合成酶基因H以a链为转录模板链，转录时mRNA自身的延伸方向为5′→3′。利用PCR扩增H基因时，需要在引物的___（填“3'端”或“5'端”）添加限制酶识别序列。为了构建基因表达载体，依据图中已知碱基序列，在PCR扩增仪中加入的引物的碱基序列为___，扩增___代后会得到等长的8条DNA片段。

(2)为协调菌体生长与产物生产之间的关系，将构建好的重组质粒转入经___处理后的枯草芽孢杆菌（D菌），在含___的培养基上筛选，得到枯草芽孢杆菌E（E菌）。进行工业培养时，培养基应选择___。
A．以木糖为唯一碳源的培养基
B．以蔗糖和木糖混合为碳源的培养基
C．以蔗糖为唯一碳源的培养基，接种2小时后添加木糖
D．以蔗糖为唯一碳源的培养基，培养结束后提取培养液，添加木糖
(3)质粒在细菌细胞中遗传不稳定、易丢失，研究者尝试将重组质粒进行改造，得到如图2所示重组质粒。利用同源区段交叉互换的方法将H基因插入枯草芽孢杆菌的基因组mpr位点，得到整合型枯草芽孢杆菌F（F菌）。请在图2方框中画出F菌的基因组___。

(4)对上述三种枯草芽孢杆菌进行培养，结果如图3，应选择___菌作为工业发酵生产的菌种，理由是___（答出三点）。

9 . 结核病是由结核杆菌引起的人畜共患病。结核杆菌通常以气溶胶形式传播，气溶胶颗粒被肺泡吞噬细胞吞噬，吞噬细胞破裂导致结核杆菌在机体内进一步传播。羊痒病是由正常细胞的非致病性肠蛋白异构化为痒病朊蛋白所致。为研制既能抗结核病又能抗羊痒病的双抗羊，科学家进行了如下操作。
(1)小鼠SP110基因是目前发现的具有抗结核杆菌感染功能的基因。研究人员为了验证SP110基因的功能，同时也为了验证山羊吞噬细胞特异性启动子MSR可以启动SP110基因在吞噬细胞内的表达，将MRS启动子与小鼠SP110基因形成融合基因，设计了下表所示的三组实验。

组别	主要操作	培养细胞后，使之破裂
对照组1	空质粒导入山羊肺泡吞噬细胞，接种适量结核杆菌	细胞培养72小时后，加入③___________，使吞噬细胞破裂，释放结核杆菌
对照组2	含有能广泛表达SP110基因的山羊肺泡吞噬细胞，①___________
实验组	②___________，接种等量的结核杆菌

取三组实验等量的细胞裂解液，用稀释涂布平板法培养，结果如下图1所示。由图可知小鼠SP110基因可用于双抗羊的研制，依据的实验现象是___________。

(2)非致病性胱蛋白是由山羊13号染色体上的PRNP基因的第三外显子控制合成的，PRNP基因的结构如图2．研究人员用新型基因敲除技术对体外培养的山羊成纤维细胞PRNP基因的外显子3序列实施定点敲除。请根据上述信息，设计一个检测敲除是否成功的思路：提取山羊成纤维细胞的DNA，根据___________设计引物进行PCR，并用___________作用于PCR产物后进行凝胶电泳，若仅获得一条电泳条带，说明定点敲除成功。

(3)用TALEN敲除载体与供体DNA表达载体（图4）共同转化体外培养的幼羊成纤维细胞，可将融合基因定点敲入PRNP基因的外显子3部位，原理如图3．请指出图4中数字1和2的分别代表的结构：1、___________、2、___________。经检测，山羊成纤维细胞中非致病性脱蛋白基因和SP110基因的表达情况是___________（填“两者均增加”或“两者均减少或不表达”或“前者减少、后者增加”或“前者增加、后者减少”）。

(4)欲用上述细胞获得双抗羊，需要用到的技术有___________（至少写出两项）。

10 . 水稻雄性不育被广泛应用于杂交育种，研究者对一雄性不育品系甲的不育及育性恢复机制进行研究。
(1)取可育品系乙与品系甲杂交，子代均不育。基因组测序发现，与乙相比，甲的线粒体中存在M基因。将M基因导入品系乙，与对照组相比，转基因植株花粉粒活性_______，说明线粒体基因M导致品系甲雄性不育。
(2)品系丙与品系甲的线粒体基因一致，但品系丙的育性正常。将品系甲与品系丙杂交，F₂ 代出现1799株育性正常和571株雄性不育的植株，说明丙的育性恢复由
_______性基因控制。若细胞核中育性相关基因用R/r表示，线粒体中育性相关基因用M/m表示，结合（1）中实验结果，品系乙与育性相关的基因组成应表示为________。
(3)利用10号染色体上另一特异的分子标记对（2）中亲本、F₁和F₂进行PCR扩增，证实育性恢复基因R位于10号染色体上。该分子标记电泳图如图1。

①图1中F₂某单株的育性为_______。
②为验证R是育性恢复基因，进行转基因实验，仅将一个R基因导入_______（选填下列字母），并与品系甲杂交，预期结果为_______（选填下列字母）。
A．品系甲 B．品系丙C． F₁中可育：不育＝1:1 D．F₁全部可育
(4)为在同一遗传背景下研究育性恢复基因R与不育基因M的关系，研究者取水稻品系乙进行如图2杂交实验。
               
为获得绝大多数核基因来自品系乙，且线粒体基因为不育型的可育品系乙-B，请选择合适品系，写出杂交实验流程_______。
检测品系乙-A和乙-B花药组织中M基因转录水平，如图3。取品系乙-A叶制备原生质体并用红色荧光标记线粒体，将R基因和绿色荧光蛋白基因融合后构建表达载体，导入该原生质体，对照组应导入_______________________，结果显示实验组绿色荧光与红色荧光位置重叠。据以上结果分析R基因恢复育性的机制。