1 . 柑橘果实贮藏期极易受病原菌侵染而腐烂，目前主要使用化学杀菌剂来控制采后病害。桔梅奇酵母是分离自柑橘果园叶片的新种酵母，可有效控制柑橘果实的腐烂，研究人员按照下图所示流程从柑橘叶片上分离得到一定浓度的桔梅奇酵母菌液，用于以下实验研究。回答下列问题：
   
实验一：研究人员以桔梅奇酵母为研究对象，制备以桔梅奇酵母为主要活性成分的液体制剂即桔梅奇酵母菌悬液，并探究其对柑橘果实采后主要病害的控制效果。
实验二：为了验证桔梅奇酵母菌悬液和活体桔梅奇酵母菌有一样的抑制柑橘果实腐烂的效果，科研人员在若干个柑橘果实中部等距离刺三个相同大小和深度的孔，并在孔内进行实验，实验过程如下表。

不同处理或测定	孔A	孔B	孔C
活病原菌	①	②	③
桔梅奇酵母悬液	+	-	④
活桔梅奇酵母菌	-	+	⑤
一段时间后测定
测定柑橘果实发病率	⑥	⑦	⑧

(1)下列操作过程遵循无菌操作规范的有______

A．对培养基、培养皿等进行湿热灭菌

B．用紫外线对超净工作台和柑橘叶片进行消毒

C．在酒精灯火焰附近进行接种

D．对双手及台面进行酒精消毒

E．对接种工具进行干热灭菌

F．接种过程，试管口、瓶口等可通过火焰灼烧灭菌

G．为了避免杂菌污染，尽量戴一次性手套进行操作

(2)图1中乙培养基与甲培养基相比，增多的一种成分是______；由图可知，过程④使用的接种方法是_______，判断依据有：①_________，②_________。
(3)从简单、容易操作的角度看，实验中所需病原菌可从________获取。
(4)与化学杀菌剂相比，将桔梅奇酵母菌悬液应用于柑橘防腐保鲜有哪些优、缺点____？（优点和缺点各写出1点即可）。
(5)表中①②③的处理分别为_______（用“+”或“-”表示），④和⑤的处理分别为_______（用“+”或“_”表示）。
(6)如果实验成功，则⑥⑦⑧大小比较关系是______（用编号和“=”或“>”或“<”表示）。

2 . 回答下列（一）（二）小题：
（一）某科研小组尝试从自然发酵的泡菜中分离纯化优良乳酸菌，并对其进行产酸能力、生长能力和亚硝酸盐降解能力的测定，以挑选最优菌种。下表为该小组制作的提取分离乳酸菌的培养基配方，其中溴甲酚绿遇酸变黄。

水	牛肉膏	蛋白胨	酵母膏	番茄汁	葡萄糖	吐温	碳酸钙	溴甲酚绿
100mL	1g	1g	1g	20g	1g	0.05mL	1.7g	0.01g

请回答下列问题：
(1)配制该培养基，除表中的成分外还需添加2g的______；添加碳酸钙除了方便观察是否产酸，还可以产生CO₂，以维持培养基______的恒定。
(2)初步筛选：应用____________方法进行分离，挑选出______的菌落作为初筛菌，再分别挑取其中形态大小各不相同的菌落进行菌种纯化；最终获得若干个不同的菌种用于后续测定。
(3)生长能力和亚硝酸盐降解能力的测定：光电比色法可用于细菌细胞密度的测定，OD₆₀₀指的是某种溶液在600nm波长处的吸光值。吸光值与溶液中吸光物质的浓度呈正比，通常用于细菌细胞密度（OD₆₀₀）测量。在无菌条件下将不同菌种分别接种至MRS—NaNO₂的培养基中，37℃厌氧培养24h。再将菌液______，测定OD₆₀₀值，OD₆₀₀值相对较小的菌株生长能力______。并通过测定发酵前后亚硝酸盐的含量，可以计算出______。
（二）面对新冠疫情，最常见的检测方法是新冠病毒核酸检测，原理为实时荧光定量PCR（RT—PCR）检测法，技术流程如下图所示，①②③表示相关步骤。请回答：

(4)PCR技术与DNA体内复制过程相比，两者的复制方式都是____________。RT—PCR过程中，需先以RNA为模板合成cDNA，故装置中需添加______酶。
(5)过程①中，RNA提取裂解液可同时灭活病毒，原因是______。采集到的样本要迅速进行病毒灭活处理，其目的是____________。步骤③需要的酶是______，引物F和引物R是根据______序列合成的。
(6)在进行新冠病毒核酸检测时，通常以病毒的ORFlab基因为检测的目标基因，是因为ORF1ab基因具有______的特点。检测试剂中还加有“阳性对照”和“阴性对照”，阴性对照的主要作用是____________.

3 . 请回答下列“生物技术实践”的相关问题
（一）关于细菌的培养，请回答：
（1）在细菌培养时，培养基中能同时提供碳源、氮源的成分是_________（填“蛋白胨”“葡萄糖或NaNO₃”）。通常，制备培养基时要根据所培养微生物的不同来调节培养基的pH，其原因是___________。
（2）用平板培养细菌时一般需要将平板____________（填“倒置”或“正置”）。
（3）有些使用后的培养基在丢弃前需要经过____________处理，这种处理可以杀死丢弃物中所有的微生物。
（二）为获取可降解高盐度工业废水中有机物的耐盐菌，研究人员进行了如下实验：
①制备含3%NaCl的固体培养基，以及含3%、5%和7%NaC1以高盐度工业废水中有机物为碳源的液体培养基；
②将高盐度废水采用平板划线法接种于3%NaCl的固体培养基上，如图一。然后置于适宜条件下培养一段时间，观察形成的菌落特征；
③将分离纯化后的菌株接种到固体斜面培养基上，适宜条件下培养适当时间，将试管置于4℃冰箱中保藏待用；
④取固体斜面上的菌株制成菌液，取等量菌液，分别加入到步骤①中制备的3组液体培养基中摇床培养35小时，定时取样统计活菌数目。测定结果如图二所示。

回答下列问题：
（1）配制培养基时，灭菌、添加NaCl溶液和调节pH的先后顺序是__________________。
（2）步骤②平板划线操作过程中，第一次划线前灼烧接种环的目的是防止杂菌污染，第二次及之后的几次划线前灼烧接种环的目的是______________。完成图一所示操作，至少需要灼烧接种环_________次。
（3）步骤④中常采用______________法统计活菌数目。直接从静置的培养液中取样计数的做法是错误的，正确的操作是___________________________。若每种浓度设3个重复实验，每次统计活菌数目时，需要从_________个培养瓶中取样。
（4）由图二可知，该耐盐菌最适合处理含_________（浓度）NaCl的废水。用该耐盐菌处理较高盐度工业废水时，需要__________________（合理措施），才能达到理想效果。
（三）多种微生物在中国的传统发酵技术中得到利用，请回答下列问题
（1）制作果酒、果醋的两类微生物分别是______________和______________。果醋制作过程中菌种的呼吸方式是______________。
（2）乳酸菌常用于泡菜的制作，腌制泡菜过程中亚硝酸盐含量的变化是____________。亚硝酸盐可与对氨基苯磺酸发生____________反应，这一产物再与N-1-萘基乙二胺偶联，形成紫红色产物，可用_____________法定量。
（四）为获得果胶酶，科研人员进行了下列果胶酶高产菌株的分离、筛选、鉴定及果胶酶在生产上的应用试验。
（1）为分离产生果胶酶的某种霉菌，科研人员配制了如表所示成分的培养基，该表中应加入的成分a是_____________，该成分在培养基中的作用为___________；在各种成分溶解配制好后应将pH调到_____________，再进行高压蒸汽灭菌。

成分	K2HPO4	MgSO4	NaNO3	FeSO4	a	琼脂	蒸馏水
质量	0.1g	0.5g	3g	0.01g	2g	15g	加至1L

（2）将获得的菌株进行扩大培养后，再用____________工具从滤液中获得粗提的果胶酶。如要检测获得的果胶酶活性，可先将等量的果胶酶和果胶混合处理适宜时间，再加入等量的____________，最后根据沉淀物的生成量来判断。
（3）在果汁和果酒制作过程中，常用果胶酶处理来提高相应产品的____________；生产上通过明胶、海藻酸钠包埋剂或戊二醛交联剂等对果胶酶进行____________处理，以减少酶的使用量，降低生产成本。

4 . I、保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌是酸奶生产中的两种常用乳酸菌种，二者共生使牛乳快速发酵制成酸奶。研究者以一株保加利亚乳杆菌（记作A）和一株嗜热链球菌（记作B）为实验材料，对脱脂乳进行发酵，研究两者共生机制以期提高酸奶品质。
II、苯酚（C₆H₅OH）是重要的化工原料，被广泛应用于工业生产中，易形成污染，具有致癌、致畸和致突变作用。苯酚降解菌能分解工业废水中的苯酚。自然界中能分解苯酚的微生物有几百种，多为细菌、放线菌等。分离和纯化高效降解苯酚的微生物的实验流程如图1所示。请分析回答下列问题。
(1)发酵前先将A和B菌种接种到M17培养基中培养进行活化，M17培养基的配方如下表所示，其中乳糖为菌种生长提供的营养成分是______。从物理性质上划分，该培养基属于______培养基。活化培养过程应控制的氧气条件是_________（填“无氧”或“有氧”）。
表   M17培养基的配方

组分	蛋白胨	酵母提取物	牛肉膏	乳糖	抗坏血酸	MgSO4·7H2O	β-甘油磷酸二钠
含量	10.0g	2.5g	5.0g	5.0g	0.5g	0.2g	5g
调节pH至7.0，定容至500mL

(2)取等量活化好的A和B菌种分别接种到250mL发酵培养基中开始发酵，发酵培养基的成分应为_________。每隔2h取出发酵液，测定pH值和菌种数量，结果如图1、图2所示。据图可知，数量增长更快的菌种为_________，发酵过程中具有持续产酸能力的菌种是_______。

(3)分离纯化菌种，应采用图2中________（填字母）所示的划线分离操作，使用的划线工具是_______，其正确操作过程中，划线工具至少要灼烧_________次。

(4)平板分离得到的单个菌落大小、颜色、隆起度等不完全一致的原因是_______。

6 . 保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌是酸奶生产中的两种常用乳酸菌种，二者共生使牛乳快速发酵制成酸奶。研究者以一株保加利亚乳杆菌（记作A）和一株嗜热链球菌（记作B）为实验材料，对脱脂乳进行发酵，研究两者共生机制以期提高酸奶品质。
(1)发酵前先将A和B菌种接种到M17培养基中培养进行活化，M17培养基的配方如下表所示，其中乳糖为菌种生长提供的营养成分是 _____________。从物理性质上划分，该培养基属于________培养基，判断依据是 ___________________ 。活化培养过程应控制的氧气条件是___________（填“无氧”或“有氧”）。
表   M17培养基的配方

组分	蛋白胨	酵母提取物	牛肉膏	乳糖	抗坏血酸	MgSO4·7H2O	β-甘油磷酸二钠
含量	10．0 g	2．5 g	5．0 g	5．0 g	0．5 g	0．2 g	5 g
调节pH至7．0，定容至500 mL

(2)取等量活化好的A和B菌种分别接种到250 mL发酵培养基中开始发酵，发酵培养基的成分应为_________。每隔2 h取出发酵液，测定pH值和菌种数量，结果如图1、图2所示。据图可知，数量增长更快的菌种为_________，发酵过程中具有持续产酸能力的菌种是___________。

(3)发酵过程中B代谢可产生大量丙酮酸、甲酸、叶酸等物质，其中甲酸是嘌呤合成的前体物质，叶酸是嘌呤和氨基酸合成的辅因子。将A和B菌种共同接种到250 mL发酵培养基中，测定pH值和A、B菌种总量，结果如图3所示。进一步检测发现，共同培养初期A的增长速度明显高于单独培养，结合上述信息分析其原因是 __________。16小时后，共同培养的菌种数量开始减少的主要原因是______________。
(4)常规微生物实验中，下列物品及其灭菌方法错误的有__________。

A．用干热灭菌法对培养基进行灭菌

B．用火焰灼烧对接种环进行灭菌

C．用过滤除菌法对空气进行灭（除）菌

7 . 下图是从土壤中筛选细菌的过程。请回答下列问题：
   
(1)土壤中存在能分解尿素的细菌，这些细菌中产生的_______催化尿素分解成NH₃和CO₂。某同学配置以下的培养基成分：葡萄糖10.0g、蛋白胨5.0g、KH₂PO₄1.4g、Na₂HPO₄2.1g、尿素1.0g、琼脂15.0g、H₂O（定容至1L）。分析培养基的成分可知，上述培养基_______（填“能”或“不能”）用于分离出能分解尿素的细菌，理由是_______，鉴别培养基还需添加_______作指示剂。
(2)在向培养基接种土壤稀释液中微生物时，最常用的方法是_______和_______。对培养基进行灭菌处理时，应采用_______法。
(3)若在3个细菌培养基平板上均接种稀释倍数为10⁵的土壤样品0.1mL，培养一段时间，平板上菌落数分别为35个、33个、34个，则可推测每克土壤样品中的细菌数为_______个。运用这种方法统计的结果往往较实际值_______（填“偏大”或“偏小”），原因是_______。
(4)另一小组的同学为从富含纤维素的土壤中分离获得纤维素分解菌的单菌落，设计了甲乙两种培养基（成分见下表）

	酵母膏	无机盐	淀粉	纤维素粉	琼脂	刚果红	水
培养基甲	＋	＋	＋	＋	－	＋	＋
培养基乙	＋	＋	＋	－	＋	＋	＋

注：“＋”表示有，“一”表示无
据表判断，培养基甲_______（填“能”或“不能”）用于分离和鉴别纤维素分解菌；培养基乙_______（填“能”或“不能”）分离和鉴别纤维素分解菌。

8 . 横沙岛是上海的柑橘生产基地，柑橘果实采后贮藏期间极易受病原菌侵染而腐烂，造成重大经济损失，目前主要通过使用化学杀菌剂来控制采后病害。桔梅奇酵母是分离自柑橘果园叶片的新种酵母，可有效控制柑橘果实的腐烂，研究人员按照下图所示流程从柑橘叶片上分离得到一定浓度的桔梅奇酵母菌液，用于实验研究。
   
(1)图1中乙培养基比甲培养基多一种成分是______，④所使用的接种方法是______。
(2)实验过程中可以用高压蒸汽灭菌法进行灭菌的是（　　）。（多选）

A．培养基

B．柑橘叶片

C．接种环

D．培养皿

研究人员以桔梅奇酵母为研究对象，制备以桔梅奇酵母为主要活性成分的液体制剂即桔梅奇酵母菌悬液，并探究其对柑橘果实采后主要病害的控制效果。
(3)从简单易操作的角度看，实验中所需病原菌从______获取。
(4)与化学杀菌剂相比，将桔梅奇酵母菌悬液应用于柑橘防腐保鲜有哪些优缺点？
优点：______；
缺点：______。
为了验证桔梅奇酵母菌悬液和活体桔梅奇酵母菌有一样的抑制柑橘果实腐烂的效果，科研人员在若干个柑橘果实中部等距离刺三个相同大小和深度的孔，并在孔内进行实验，实验过程如下表。

不同处理或测定	孔A	孔B	孔C
活病原菌	①	②	③
桔梅奇酵母悬液	+	－	⑤
活桔梅奇酵母菌	－	+	④
一段时间后测定
测定柑橘果实发病率	⑥	⑦	⑧

(5)表中①②③分别表示______（用“+”或“－”表示），④和⑤分别表示______（用“+”或“－”表示）。

9 . 回答下列（一）、（二）小题：
（一）橙子富含丰富的维生素、柠檬酸和抗坏血酸等物质，鲜果和橙子加工品都深受消费者喜爱。回答下列问题：
（1）变质的橙皮表面会变绿并发软，因为表面长出了青霉菌落，青霉菌会产生_________使橙皮软化，因此要对此青霉菌进行分离纯化，可以选用以_________为唯一碳源的培养基。
（2）利用橙瓤制作橙子酒的过程：橙子去皮→橙瓤榨汁→接种→酒精发酵→橙子酒，接种时用的干酵母需用温水和_________活化。当发酵瓶中_________，即表示发酵完毕。
（3）橙瓤榨汁也可以直接用于橙子醋的制作，因为在_________和糖源充足的条件下，醋酸菌能将糖类氧化成醋酸。在生产过程中，发酵瓶中加入的果汁浓度不能过高，原因是_________。
（4）橙子中的柠檬苦素是引起果汁产生苦味的主要原因，利用球形节杆菌产生的柠檬酶处理可消除苦味。某生物实验小组将柠檬酶与海藻酸钠混合后，滴加到一定浓度的氯化钙溶液中，使液滴形成凝胶固体小球，该固定化酶的方法称为_________。工业生产中，若要将酶固定化，一般不适宜采用该方法，原因是_________。
（二）核酸检测作为确诊新型冠状病毒肺炎的金标准，写入了国家卫健委颁布的诊疗指南里，但依然出现了少数“假阴性”病例，此时采用免疫检测则可以很大程度上避免核酸检测的“假阴性”。请回答下列问题：
（1）开发核酸检测试剂盒，需要先分离毒株、获得完整基因组序列信息、设计特异性引物和探针的核苷酸序列，再据此用_________方法直接人工合成特异性引物和探针。
（2）我国研发的新型冠状病毒核酸快速检测试剂盒的检测原理是：若送检样本中存在病毒，则以病毒RNA为模板，在_________酶的作用下合成cDNA，再加入互补的荧光探针、2种引物、_________种脱氧核苷酸和耐热的__________________酶后，cDNA开始扩增，子链延伸至探针处，会水解探针释放出荧光基团产生荧光，荧光监测系统接收到荧光信号从而确诊。
（3）我国新型冠状病毒化学发光检测试剂盒采用的是免疫检测，其中的单克隆抗体是由经病毒抗原蛋白兔疫的B淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合制备的_________细胞产生的，该细胞在体外条件下做大规模培养时，为防止细胞代谢产物积累对细胞自身造成危害，应采取的措施是__________________。要获得能产生单克隆抗体的杂交瘤细胞至少要进行_________次筛选。该试剂盒能快速确诊病例，这是因为单克隆抗体具有_________等优点。