1 . 血栓调节蛋白（TM）只能在血管内皮细胞中合成，具有调节凝血的功能。为了解决异种器官移植时引起凝血紊乱的问题，科研人员研究制备了猪血管内皮特异性表达人血栓调节蛋白（hTM）的转基因猪。下图1表示部分研究过程，请回答：

注：ori是复制原点，T为终止子，puro为嘌呤霉素抗性基因，pTM为猪血栓调节蛋白，相关限制酶识别
序列及切割位点如下表：

限制酶	XhoI	claI	EcoRV
识别序列及切割位点	C↓TCGAG	AT↓CGAT	GAT↓ATC

(1)步骤①将pTM启动子插入到质粒1中，其中pTM启动子的作用是：____。
(2)步骤②设计引物时，应该在引物____端加入claI和EcoRV两种限制酶的识别序列。
(3)步骤③将hTM编码区插入质粒2中，该过程中至少需要____种酶，分别是：____。
(4)步骤③获得的质粒3经XhoI、EcoRV酶切后电泳，结果如下图2，据结果可判断目的基因____（填“成功插入”或“未插入”）质粒。

(5)质粒3导入猪胎儿成纤维细胞常用的方法是____。将处理后的成纤维细胞接种至培养皿中培养48h后经____处理分散成单个细胞，再按每孔一个细胞接种至96孔板（如上图）中，加入_____筛选获得抗性细胞，再提取抗性细胞的DNA进行PCR鉴定，将呈阳性的细胞留存待用。
(6)取留存细胞的细胞核，显微注射到____中，再经过____等技术（至少两种）获得表达人血栓调节蛋白的转基因猪。

2 . “标记”是生物技术与工程常用的技术手段，下列相关叙述错误的是（       ）

A．诱导植物原生质体融合时，通过红绿荧光蛋白标记检测细胞融合情况

B．分析工程酵母发酵产物的合成及分泌时，通过同位素标记监测产物转移路径

C．验证转基因抗虫棉是否成功时，通过RNA分子标记检测目的基因是否表达

D．对目的基因进行扩增时，可通过特定的标记技术实时定量测定产物的量

3 . PCR是一种体外迅速扩增DNA片段的技术，下列有关PCR过程的叙述，正确的是（       ）

A．待扩增的DNA两条链的解旋过程需要酶的催化

B．所用引物的长度越短，与模板链结合的特异性越强

C．在子链的形成过程中，需要四种游离的脱氧核苷酸提供原料

D．与细胞内DNA复制相比，PCR所需要的酶对高温比较敏感

4 . 在谷类食物如高粱中赖氨酸含量很低。天冬氨酸激酶（AK）和二氢吡啶羧酸合酶（DHPS）是赖氨酸合成途径中两种重要的酶，并协同控制植物中游离赖氨酸的合成速率。科学家把外源AK基因和DHPS基因导入高粱，获得转基因高粱植株若干。利用转基因高粱植株获取cDNA，进行PCR扩增并对扩增产物进行凝胶电泳，结果如图所示。下列相关叙述正确的是（       ）

A．转基因植株4、5和7是实验所需的目的株

B．转基因植株3中一定存在二氢吡啶羧酸合酶

C．转基因植株5的游离赖氨酸含量可能显著增加

D．通过基因工程获得转基因植株的原理是基因突变

5 . 1965年中国科学家人工合成了具有生物活性的结晶牛胰岛素，摘取了人工合成蛋白质的桂冠。此后科学家又提出了利用基因工程改造大肠杆菌生产人胰岛素的两种方法：AB法是根据胰岛素A、B两条肽链的氨基酸序列人工合成两种 DNA片段，利用工程菌分别合成两条肽链后将其混合自然形成胰岛素；BCA法是利用胰岛B细胞中的mRNA得到胰岛素基因，导入工程菌获得胰岛素。这两种方法使用同一种质粒作为载体。回答下列问题。

(1)由于_________________________________，“AB”法中人工合成的两种DNA片段均有多种可能的序列。“BCA”法是利用人体________________中的mRNA，再由mRNA经 ______得到的胰岛素基因，______________（填“AB”、“BCA”或“AB和BCA”）法获取的目的基因中不含人胰岛素基因启动子。
(2)如图是利用基因工程生产人胰岛素过程中使用的质粒及目的基因的部分结构。为使目的基因与载体正确连接，在设计PCR引物时可添加限制酶 ______________的识别序列，PCR引物应该添加在识别序列的______（填“3′或5′）端。通过上述方法获得人的胰岛素基因后，需要通过PCR技术进行扩增，已知胰岛素基因左端①处的碱基序列为-CCTTTCAGCTCA-，则其中一种引物设计的序列是5′-__________________-3′。通过上述方法获得人的胰岛素基因后，需要通过PCR技术进行扩增，若计划用1个胰岛素基因作模板获得m（m大于2）个胰岛素基因，则消耗的引物总量是_____________个。
(3)PCR扩增的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定，下列叙述中正确的有 ______________。

A．PCR反应体系中需加入耐高温的DNA聚合酶，该酶主要在复性过程起作用

B．待测样品中DNA分子的大小和构象、凝胶的浓度等都会影响DNA在电泳中的迁移速率

C．进行电泳时，带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动

D．琼脂糖溶液中加入的核酸染料利于DNA在紫外灯下被检测

(4)β-半乳糖苷酶可以分解无色的X-gal产生蓝色物质使菌落呈现蓝色，否则菌落为白色。先用________处理大肠杆菌后，与重组质粒混合培养一段时间，将大肠杆菌接种到添加了______________的培养基上筛选出_________的菌落即为工程菌种。

6 . RT—PCR是将RNA的反转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。以mRNA为模板，通过RT—PCR技术获取目的基因时，下列叙述正确的是（       ）

A．该过程中加入的原料是4种脱氧核苷酸

B．该过程中加入的DNA聚合酶最适温度是95℃

C．反转录形成的一个DNA片段经PCR扩增n次需要2n+1-2个引物

D．PCR时，引物中G、C碱基所占比例越高，复性所需的温度就越高

7 . 红豆杉被称作“植物界的大熊猫”，紫杉醇具有高抗癌活性。生产紫杉醇的传统方法是从红豆杉的树皮和树叶中提取，但野生红豆杉是濒危植物，此方法不利于对它们的保护。根据材料回答下列问题：
(1)为提高红豆杉细胞培养物中紫杉醇的产量，研究人员构建紫杉醇合成关键酶基因（Bapt基因）的超表达载体，并将其导入红豆杉细胞，其具体流程如下：

①Bapt基因的获取：提取红豆杉的mRNA，并通过逆转录得到其cDNA，利用PCR技术以图1中的cDNA片段为模板扩增Bapt基因，需要的引物有_____（从A、B、C、D四种引物中选择）。上述过程中，用1个图1所示片段至少要经过_____次循环，可获得与Bapt基因等长的DNA单链。
②构建Bapt基因的超表达载体并将其导入受体细胞；在超量表达Bapt基因载体的构建中，所用DNA片段和Ti质粒的酶切位点（注：图中所示限制酶切割后形成的黏性末端各不相同）如图2所示。为使DNA片段能定向插入T-DNA中，可用PCR技术在DNA片段的两端添加限制酶识别序列，M、N端添加的序列所对应的限制酶分别是_____。
③Bapt基因的检测和鉴定。将受体细胞经农杆菌液浸泡，Bapt基因会随T-DNA整合到受体细胞染色体上，继而进行植物细胞组织培养，培养基中加入_____进行筛选。
(2)PCR技术可用于目的基因的扩增，为确保准确性，在设计PCR引物时必须注意：用于PCR的引物长度通常为20~30个核苷酸，过短会导致特异性差，过长则会使反应体系有关步骤温度提高，从而超过_____的最适温度；引物3'端的碱基最佳选择是_____（填“G和C”或“A和T”），这样形成的碱基配对比较稳定，引物的“_____”端（用5或3'作答），可以被修饰，如附加限制酶位点等；连续扩增4次后需要引物至少_____个。扩增完成以后，常采用_____法来鉴定PCR的产物

8 . 通过设计引物，运用PCR技术可以实现目的基因的定点诱变。如图为基因工程中获取突变基因的过程，其中引物1序列中含有一个碱基T不能与目的基因片段配对，但不影响引物与模板链的整体配对，反应体系中引物1和引物2的5'端分别设计增加限制酶a和限制酶b的识别位点。有关叙述不正确的是（       ）

A．在PCR反应体系中还需要加入4种游离核苷酸、解旋酶、以及相关的酶等

B．第2轮PCR，引物1能与图中②结合并且形成两条链等长的突变基因

C．引物中设计两种限制酶识别位点有利于目的基因定向插入运载体

D．第3轮PCR结束后，含突变碱基对且两条链等长的DNA占1/2

9 . 某种荧光蛋白（GFP）在紫外光或蓝光激发下会发出绿色荧光，这一特性可用于检测细胞中目的基因的表达。某科研团队将某种病毒的外壳蛋白（L1）基因连接在GFP基因的5′末端，获得了L1-GFP融合基因（简称为甲），并将其插入质粒P0，构建了真核表达载体P1，其部分结构和酶切位点的示意图如下，图中E1~E4四种限制酶产生的黏性末端各不相同。下列说法正确的是（       ）

   

A．据图推断，该团队在将甲插入质粒PO时，使用了E1、E2和E4这三种限制酶

B．将P1转入体外培养的牛皮肤细胞后，若在该细胞中观察到了绿色荧光，则说明L1基因在牛的皮肤细胞中完成了表达

C．为了获得含有甲的转基因牛，最终的操作环节为胚胎移植

D．为了检测甲是否存在于克隆牛的不同组织细胞中，可使用PCR方法进行鉴定

10 . 下列有关DNA片段的扩增及电泳鉴定实验的叙述，正确的是（       ）

A．PCR缓冲液中一般要加Mg2+，用于激活DNA聚合酶

B．琼脂糖熔化后加入适量的核酸染料混匀，用来指示DNA迁移的位置

C．在凝胶中的DNA分子的迁移速率只与DNA分子大小有关

D．为防止PCR产物溢出电泳槽，电泳缓冲液加入电泳槽时不能没过凝胶