1 . 大引物PCR定点突变常用于研究蛋白质结构改变导致的功能变化。单核苷酸的定点诱变需要通过PCR获得，其过程如图所示。下列有关分析错误的是（       ）

   

A．向PCR体系中加入Mg²⁺能激活DNA聚合酶

B．PCR-I经过一次循环即可获得大引物模板

C．PCR-I得到的产物均作为PCR-Ⅱ的引物

D．PCR-Ⅱ选用大引物和引物乙以获得定点诱变的基因片段

2 . 哺乳动物体内一定含量的w—3多不饱和脂肪酸（LCPUFA）可以起到预防心血管疾病的作用，但LCPUFA在大多数动物体内不能合成，只能从食物中摄取。科研人员从秀丽隐杆线虫中获得LCPUFA合成酶基因fat-1（1229bp），培育转fat—1基因家兔，其部分流程如图一所示。

(1)质粒上复制原点序列为复制的起始区域，该区域的序列容易解旋成单链，据此推测该区域中___碱基所占的比例较高，启动子的作用是___。
(2)在构建PEBf质粒时，为确保fat—1基因按正确方向插入，需要双酶切，还需对fat—1基因的引物进行相应设计。已知fat—1基因转录的模板链为a链，与b链结合的引物5’端添加了限制酶识别序列GAATTC，则另一引物5’端需添加的限制酶识别序列为___，理由是___。
(3)转染是将外源分子如DNA、RNA等导入真核细胞的技术。为了检验图一家兔成纤维细胞是否转染成功，科研人员分别提取培养液中各细胞的DNA，利用fat—1基因引物进行PCR扩增后电泳，部分结果如图二所示。据图分析，1组和2组分别是___细胞组PCR产物。
(4)检测转基因家兔细胞中是否含有LCPUFA合成酶，可采用___技术。如果fat—1基因已正确插入PEB质粒且成功转染，但在转基因家兔细胞中没有检测到LCPUFA合成酶，从基因表达载体结构的角度分析，可能的原因是___。

3 . 人血清白蛋白（HSA）是由肝脏细胞合成的，具有重要的医用价值，原本只能从血清中提取，现利用基因工程的方法生产HSA。请结合相关知识回答下列问题。

（图甲为获取的含HSA基因的DNA片段及酶切位点：图乙是三种限制酶的识别序列；图丙为质粒结构示意图）。
(1)科研人员利用人肝细胞中的___构建出cDNA文库，通过该方法合成的DNA含量较少，可通过PCR进行扩增获取较多的DNA分子，根据该基因的序列（5'—CTAGGTCGAAATTC⋯TCTCCAACGATCGG-3'），应选择___作为PCR的引物。
A.引物Ⅰ是5'-CTAGGTCGAAHTTC-3'引物Ⅱ是5'-CCGATCGITGGAGA-3'
B.引物Ⅰ是：5'-CTAGGTCGAAHTTC-3'引物Ⅱ是5'-CTCAACGATCGG-3'
C.引物Ⅰ是5'-GATCAGCTTTTAAG-3'引物Ⅱ是5'-AGAGGTTGCTAGCC-3'
D.引物Ⅰ是5'-GATCAGCTTTTAAG-3'引物Ⅱ是5'-CCGATCGTTGGAGA-3'
为使HSA基因能与质粒正确连接，根据图甲、乙、丙，应选择限制酶___切割目的基因。
(2)PCR扩增结束后需要对PCR产物进行检测，常采用电泳的方法。电泳一段时间后进行检测，若电泳带有___条，且与DNA Marker对比，产物大小正确，表明PCR扩增成功。
(3)目的基因与质粒连接后可以导入到不同的受体细胞中进行表达。若导入到原核生物大肠杆菌中，可用CaCl₂处理大肠杆菌，有利于重组质粒的导入。但由于原核细胞中缺少___等细胞器，不能对表达产物进行加工，可能会影响蛋白质的功能。若将重组质粒导入到真核细胞，如小鼠细胞中，则可避免上述问题的产生。现利用小鼠乳腺作为生物反应器生产该蛋白，可将重组质粒通过___法导入小鼠的___细胞中，然后将转化的细胞进行培养，由于无法进行全体外胚胎培养，___成为胚胎工程中获得转基因小鼠的唯一方法。利用___技术检测小鼠乳腺分泌物，可以判断目的基因是否表达。

4 . 启动子是合成生物学、代谢工程中控制和调控基因表达的重要工具，其作用强度会影响基因表达产物的产量和细胞代谢水平。为寻找合适的启动子，研究人员获得了POLI～POL5、CBF1共6种启动子，将其分别与荧光蛋白基因EGFP构建成重组型启动子并导入毕赤酵母细胞，以研究启动子的作用强度。含CBF1-EGFP重组型启动子质粒的结构如图所示，用于扩增CBF1和EGFP的引物的碱基序列如表1所示。回答下列问题：

引物名称	序列（5′→3′）
CBF1 引物1	CCGGAATTCCGTTAGGACTTCTT
CBF1 引物2	TCCTCGCCCTTGCTCACCATT
EGFP 引物1	ATGGTGAGCAAGGGCGAGGA
EGFP 引物2	ACGCGTCGACTTACTTGTACAG

注：引物序列之外、CBF1和EGFP无表中相关限制酶识别和切割
(1)在PCR扩增启动子CBF1时，CBF1引物1与模板链结合后，在____酶的作用下将脱氧核苷酸连接到引物的____（填“3′”或“5′”）端，以延伸子链。
(2)限制酶及识别序列如表2所示。构建CBF1-EGFP重组型启动子质粒时，要选择限制酶分别____对图中a、b两处进行切割，EGFP的下游需要添加____序列，使转录终止。

限制酶	BamHⅠ	EcoRⅠ	SalⅠ	SmaⅠ
识别和切割序列	G↓GATTC	G↓AATTC	G↓TCGAC	GGG↓CCC

表2
(3)检测含CBFI-EGFP重组型启动子质粒是否构建成功时，将重组质粒导入大肠杆菌。培养后将大肠杆菌涂布到含有____的培养基上，挑选单菌落并提取DNA，经酶切后利用表1中所示的____两种引物进行PCR扩增和鉴定。
(4)EGFP基因能表达荧光蛋白，蛋白质含量与荧光强度呈正相关。为比较POL1～POL5、CBFI这6种启动子的作用强度，应分别检测____。若POL3的作用强度最强，则预期结果是____。

5 . 目的基因和载体如果用同一种限制酶处理，连接时会出现正反接的情况，为鉴定筛选出的表达载体中是否含有正确插入目的基因的重组质粒，拟设计引物进行PCR后，结合电泳技术鉴定，图示为甲、乙、丙3条引物在正确重组质粒中的相应位置，其中目的基因为长度300bp的片段。下列有关说法错误的是（       ）

   

A．PCR复性温度不宜太低，避免引物错配和模板链形成双链

B．电泳条带迁移的位置和速度与DNA分子的大小、带电量和构象有关

C．选取引物甲、丙，扩增出450bp长度片段时，可以说明目的基因正接

D．选取引物甲、乙，扩增出400bp长度片段时，可以说明目的基因反接

6 . 随着基因组编辑技术的发展，科学家可以通过基因敲除、插入等手段有目的地改造特定基因。影响小鼠内耳形态的基因A突变会导致遗传性耳聋，研究人员尝试对该病进行基因治疗。相关信息如图所示。

   

(1)图1表示CRISPR/Cas9基因编辑系统，该系统由sgRNA及Cas9蛋白组成。sgRNA与目标DNA结合需遵循___原则，结合后sgRNA引导Cas9蛋白切割靶序列的双链DNA，导致___键断裂。
(2)同源重组是指在DNA断裂的情况下，含有同源区段的DNA之间发生的重组。科研人员尝试利用同源重组原理对耳聋小鼠进行基因治疗。
①利用___技术扩增野生型小鼠的基因A，该技术体系需要添加引物，引物的作用是___。扩增基因A后，需将其插入到载体，载体需要具备的条件有___（答出两点即可）。科研人员尝试利用该基因表达载体与耳聋小鼠的DNA进行同源重组，效果不佳。
②在上述基础上，科研人员构建出如图2所示的腺病毒表达载体。该表达载体中引入sgRNA基因、Cas9基因和sgRNA识别序列的目的是___。
③进一步研究发现该方案可以有效纠正小鼠的突变基因，从而治疗小鼠的遗传性耳聋。人体内基因A突变也会导致遗传性耳聋，欲将该方案用于临床治疗，从安全性角度还应关注___。

7 . 研究人员将玉米的光敏色素基因A（256bp）导入到棉花体内，对获得的1~4号转基因棉花进行基因A的检测，电泳结果如图。下列叙述错误的是（       ）

A．转基因技术用到的工具有限制酶、DNA连接酶和载体

B．可采用花粉管通道法使基因A进入棉花的胚囊

C．PCR反应过程中每次循环都要经历目的不同的两次升温和一次降温

D．由电泳结果可知，1、3和4号棉花均导入基因A且培育成功

8 . 反向PCR可用于扩增未知序列，其原理如下图所示。下图链状DNA分子内侧是已知序列，外侧为未知序列。下列说法错误的是（　　）

A．反向PCR利用了DNA半保留复制的原理

B．图3中DNA进行PCR的过程中，沿引物A延伸子链的方向是逆时针

C．图3所示PCR 产物含有EcoRI的酶切位点

D．反向PCR产物最终还是环状DNA分子，包含已知序列的完整序列

9 . PCR技术在生物工程中应用广泛，PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定，下列有关叙述正确的是（　　）

A．PCR反应体系中的DNA 聚合酶在90℃条件下不会失活，在复性过程中起作用

B．真核细胞内的DNA聚合酶均属于在细胞核内发挥作用的亲核蛋白

C．DNA复制时需消耗能量，因此PCR反应体系中必须加入ATP以供能

D．采用PCR技术对一个双链DNA进行扩增，第n次循环共需要引物2ⁿ个

10 . 下列关于“DNA的粗提取与鉴定”“DNA片段的扩增及电泳鉴定”操作和结果的叙述，错误的是（　　）

A．将过滤液放入4℃冰箱或加入预冷酒精都可抑制DNA酶的活性

B．在含粗提取的DNA溶液中加入二苯胺试剂，溶液即呈蓝色

C．DNA分子经过染色通常在紫外灯下才能观察得到图谱

D．实验退火温度过低，容易出现杂带