1 . HA蛋白是禽流感病毒的重要抗原。鸡卵清蛋白是由输卵管上皮细胞中卵清蛋白基因特异性表达后分泌至输卵管内，参与构成鸡蛋清的蛋白质。下图是利用基因工程技术制备HA蛋白鸡输卵管生物反应器的过程。几种可供选择的限制酶识别序列如下，下列说法错误的是（       ）

       

A．①为逆转录过程，该过程需要逆转录酶、4种游离的脱氧核苷酸等组分

B．目的基因与鸡卵清蛋白基因启动子拼接前应先在目的基因两端分别引入HindⅢ和EcoRⅠ的识别序列

C．利用PCR技术扩增目的基因时，复性温度偏低、引物特异性差均可导致产物中出现部分非目标序列

D．基因表达载体导入受精鸡胚的胚盘可以使用显微注射法

2 . Ⅰ.赖氨酸是人体细胞不能合成的必需氨基酸。科学家把某种必需氨基酸含量多的蛋白质编码基因（R）导入玉米中，使玉米中赖氨酸的含量提高30%。回答下列问题。

(1)随着测序技术的发展，通过化学合成法得到R基因。利用PCR技术扩增R基因时，需要在一定的缓冲液中才能进行，其中需要加入___酶。为了特异性扩增R基因序列，需根据___设计特异性引物。
(2)在构建基因表达载体时，其中载体上启动子的作用___，若为了避免R基因和质粒的自连或反向连接，提高重组效率，应该选择的限制酶是___。
(3)随着转化方法的突破，农杆菌侵染玉米这种单子叶植物也取得了成功。科研人员从新鲜的玉米叶片上取下的圆形小片与农杆菌共培养，当农杆菌侵染玉米细胞后，能将Ti质粒上的___转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上。
(4)检测R基因是否表达的方法是___。在基因工程中若要培养转基因小鼠，将基因表达载体导入受体细胞常用的方法是___。
Ⅱ.乳腺生物反应器是将外源基因定位表达于哺乳动物的乳腺中，通过转基因动物分泌的乳汁来生产重组蛋白，例如，生产可用于治疗血液病、创伤性出血等疾病的重组人凝血因子VⅡ（rhFVⅡ）。请回答下列问题：
(5)为获得人凝血因子，首先要从细胞中获取总RNA，通过___获得cDNA，再进行PCR获得人凝血因子基因。基因表达载体除了包括目的基因外还包括___（至少答出2点）。
(6)人凝血因子cDNA中不含限制酶识别序列，无法直接构建基因表达载体，因此，在PCR时需要在引物上加入限制酶的识别序列，应加在引物的___（填“3’”或“5’”）端才能不影响PCR的顺利进行。
(7)膀胱生物反应器与乳腺生物反应器的优点相同：收集产物蛋白比较容易，不会对动物造成损伤。此外，膀胱生物反应器还具有的显著优势在于不受转基因动物的___（答出1点即可）限制，而且从尿液中提取蛋白质比从乳汁中提取更简便、高效。

3 . 下列关于PCR的叙述错误的是（       ）

A．用PCR方法扩增目的基因时需要知道基因的部分序列

B．复性温度过高可能导致PCR反应得不到任何扩增产物

C．PCR技术是在生物体外快速扩增目的基因的过程

D．第四轮循环产物中含有两种引物的DNA片段所占比例为3/4

4 . PHB2蛋白是一种动物肝脏合成具有抑制细胞增殖的作用。为初步探究某动物PHB2蛋白抑制人宫颈癌细胞增殖的原因，研究者从基因数据库中获取了该蛋白的基因编码序列（简称phb2基因），大小为0.9kb（1kb=1000碱基对），利用大肠杆菌表达该蛋白。回答下列问题：
(1)为获取phb2基因，提取该动物_____内的RNA，再经_____过程得到cDNA，将其作为PCR反应的模板，并设计_____来扩增目的基因。PCR扩增过程为_____三个步骤。
(2)图1为所用载体图谱示意图，图中限制酶的识别序列及切割位点见下表。为使phb2基因（该基因序列不含图1中限制酶的识别序列）与载体正确连接，在扩增的phb2基因两端分别引入_____和_____两种不同限制酶的识别序列。选择这两种限制酶的理由是_____。

   

相关限制酶的识别序列及切割位点

名称	识别序列及切割位点	名称	识别序列及切割位点
HindⅢ	A↓AGCTT TTCGA↑A	EcoRI	G↓AATTC CTTAA↑G
PvitⅡ	CAG↓CTG GTC↑GAC	PstI	CTGC↓AG GA↑CGTC
KpnI	G↓GTACC CCATG↑G	BamHI	G↓GATCC CCTAG↑G

注：箭头表示切割位点
(3)转化前需用_____处理大肠杆菌细胞，使其处于吸收环境中DNA的生理状态，以提高转化效率。
(4)将转化后的大肠杆菌接种在含氨苄青霉素的培养基上进行培养，随机挑取菌落（分别编号为1、2、3、4）培养并提取质粒，用（2）中选用的两种限制酶进行酶切，酶切产物经_____方法分离，结果如图2，_____号菌落的质粒很可能是含目的基因的重组质粒。

   

注：M为指示分子大小的标准参照物；小于0．2kb的DNA分子条带未出现在图中

5 . 科学家将海鱼的抗冻蛋白基因用PCR技术扩增，如图1是扩增的目的基因的示意图。为寻找合适的载体，科学家对某载体用EcoRⅠ和SmaⅠ两种限制酶进行酶切后，再利用琼脂糖凝胶电泳得到图2所示图谱（其中1号泳道是标准DNA样品的电泳结果，2号、3号、4号泳道分别是用EcoRⅠ单独处理SmaⅠ单独处理、两种酶共同处理后的电泳结果）。下列说法错误的是（       ）

A．应选用引物2和引物3对目的基因进行扩增

B．由图2可知该载体DNA分子中两种限制酶的酶切位点各有一个

C．限制酶EcoRⅠ和SmaⅠ的酶切位点最短相距约200bp

D．扩增5次后可得到16个等长的目的基因片段

6 . 生物技术与工程学相结合，可研究、设计和加工生产各种生物工程产品。下列有关叙述正确的是（       ）
①由于外植体在植物组织培养过程中不感染病毒，用任何外植体都可制备脱毒苗
②由iPS细胞产生的特定细胞，可以在新药的测试中发挥重要作用
③胚胎移植作为胚胎工程的前端技术环节，推动了胚胎工程其他技术的研究和应用
④PCR反应过程可以在PCR扩增仪中自动完成，而后常用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR的产物
⑤蛋白质工程仅以蛋白质结构为基础逆中心法则进行，就可以改造或制造新的蛋白质

A．①③

B．②④

C．②③④⑤

D．①③④⑤

7 . 病毒没有细胞结构，在生物学中应用广泛。下列有关病毒在生物学中的应用的叙述，错误的是（       ）

A．病毒经灭活处理后，常用于介导植物细胞的融合

B．某些病毒的DNA经改造后，可用作基因工程的载体

C．病毒经灭活处理后，其表面的抗原蛋白可以制成疫苗

D．PCR技术可用于检测机体是否感染该种病毒

8 . 人血清白蛋白（HSA）是血浆蛋白的主要成分，具有维持血浆渗透压和进行物质运输的功能。科学家利用转基因技术获得转HSA基因的大肠杆菌，通过发酵工程，实现HSA的大量生产，下图表示HSA基因。下列叙述错误的（       ）

A．PCR过程每次循环分为3步，其中温度最低的一步是第二步

B．扩增出HSA基因并用于表达载体的构建，应选择引物Ⅱ和引物Ⅲ

C．在PCR反应缓冲液中加入Mg2+的作用是激活耐高温的DNA聚合酶

D．用PCR方法获得HSA基因，可通过两轮PCR循环获得HSA基因

9 . PCR扩增的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定，下列相关叙述正确的是（       ）

A．带负电的DNA分子在电泳时由负极向正极移动

B．在凝胶中DNA分子的迁移速率与DNA分子的大小、构象等有关

C．PCR反应体系中只需添加Mg2+、引物、模板、TaqDNA聚合酶

D．采用PCR技术对一个DNA进行扩增，若每个DNA分子的每条链都做模板，则第n次循环共需要引物2n个

10 . 某动物体内含有研究者感兴趣的目的基因，研究者欲将该基因导入大肠杆菌的质粒中保存。该质粒含有氨苄青霉素抗性基因（AmpR）、LacZ基因及一些酶切位点，其结构和简单的操作步骤如下图所示。回答下列问题：

(1)第①步中，利用PCR技术可在体外扩增目的基因，其扩增循环一般分___________、__________、_________三步。
(2)第②步中，应选择用________限制酶切割质粒和含有目的基因的DNA片段。
(3)第③步中，为了使质粒DNA与目的基因能连接，还需要在混合物中加入________ 。
(4)第④步中，将目的基因导入大肠杆菌前，需要用Ca^2＋处理大肠杆菌，目的是_______________。
(5)第⑤步中，培养基中除了加入大肠杆菌所必需的营养物质外，还需要添加以便筛选导入目的基因的大肠杆菌。含有重组质粒的大肠杆菌菌落将呈现________色，原因是________。