1 . PCR 技术是模拟体内DNA 的天然复制过程，在体外扩增DNA 分子的一种分子生物学技术。图中引物为单链DNA片段，它是子链合成延伸的基础。下列叙述正确的是（　　）   

A．PCR缓冲溶液中一般要添加Mg2+，因为解旋酶需要Mg2+激活

B．设计引物时需要避免引物之间因碱基互补配对而造成引物自连

C．在第四轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的目的基因

D．理论上第3 轮循环需要消耗引物 14个

2 . 科学家为了提高干扰素的抗病毒活性和储存稳定性，采用重叠延伸PCR技术，将干扰素基因中相应位点的C//G碱基对特定突变为G//C碱基对，从而使干扰素中的第17位氨基酸由半胱氨酸变成丝氨酸。该技术采用具有互补末端的引物，使PCR产物形成了重叠链，从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸，将不同来源的扩增片段重叠拼接起来，获得定点突变的干扰素基因，然后导入大肠杆菌生产表达新的干扰素，原理如下图。下列说法正确的是（　　）

A．通过“PCR体系2”获得由c、d链构成的完整DNA分子至少需要进行3次循环

B．可以通过a链和d链或者b链和c链获得定点突变的干扰素基因

C．“PCR体系2”中加入的引物是引物3和引物4

D．通过重叠延伸PCR技术对干扰素的改造属于蛋白质工程

3 . 基因敲除是通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术。科学家常借助基因敲除技术，使特定的基因功能丧失，从而使部分功能被屏蔽，并可进一步对生物体造成影响，进而推测出该基因的生物学功能。来源于λ噬菌体的Red同源重组系统就可用于大肠杆菌等一系列工程菌的基因敲除。
(1)Red同源重组系统由λ噬菌体的exo、bet、gam3个基因组成，分别编码EXO、BET、GAM3种蛋白质。EXO为双链核酸外切酶，可以结合在双链DNA的末端，按照5'→3'的方向逐步降解DNA单链，进而产生___（选填“3′”或“5′”）黏性末端；BET结合在exo外切产生的末端单链上，促进其与受体细胞内正在复制的靶序列进行同源重组，替换靶基因；GAM蛋白能够抑制受体细胞内核酸外切酶活性，进而___（选填“抑制”或“促进”）受体细胞对外源DNA的降解。
(2)Red同源重组技术要用到质粒pKD46，该质粒含有温度敏感型的复制起点oriR101，在30℃培养时可以正常复制，而高于37℃时会自动丢失；还有由ParaB启动子调控的exo、bet、gam基因，需要L-阿拉伯糖诱导表达。λ-Red系统介导的基因敲除过程如图1所示。
   
①首先，要将pKD46导入处于___（某种状态）的大肠杆菌，为使pKD46在细菌内正常复制、Red重组酶正常合成，必需满足___的培养条件。过程Ⅰ是用含有青霉素的培养基筛选成功导入了pKD46的大肠杆菌，这说明___。
②然后，用PCR技术扩增卡那霉素抗性基因，PCR引物由两部分组成，靠近5'端的区域为___的序列，靠近3'端的区域与模板DNA互补，将获得的线性DNA片段导入大肠杆菌，通过同源重组将大肠杆菌基因组DNA上的特定靶基因敲除。
③为筛选出同源重组成功（即靶基因被敲除）的大肠杆菌，过程Ⅱ所用的培养基必需含有___；然后再通过___，把质粒pKD46除去。
(3)上述操作使得大肠杆菌基因组DNA上的靶基因被卡那霉素抗性基因取代，若想将卡那霉素抗性基因也清除，需要借助于FLP/FRT位点特异性重组系统。FRT是有方向性的，不同方向FRT位点经重组酶FLP作用结果不同，具体如图2所示。

   

因此在PCR扩增卡那霉素抗性基因时需在该基因___（填字母）。

A．左侧引入一个FRT位点

B．右侧引入一个FRT位点

C．两侧引入两个同向的FRT位点

D．两侧引入两个反向的FRT位点

4 . RT－PCR是将mRNA逆转录（过程Ⅰ）和cDNA（mRNA逆转录产生的互补DNA）聚合酶链式反应（过程Ⅱ）相结合的技术，具体过程如图所示，下列有关说法错误的是（　　）

A．过程Ⅰ和过程Ⅱ的反应体系中主要用到工具酶分别是逆转录酶和耐高温的DNA聚合酶

B．过程Ⅱ中拟对m个单链cDNA进行n次循环的扩增，理论上至少需要m×2n个引物B

C．引物A和B的长度越长、G和C比例越高，则过程Ⅱ内循环步骤中的复性温度就越高

D．利用RT－PCR技术获取的真核生物的目的基因通过转基因技术可以在原核细胞中表达

5 . 20世纪70年代，Fredsanger发明了双脱氧终止法对DNA进行测序。其原理如图所示，在4支试管中分别加入4种脱氧核苷三磷酸（dNTP）和1种双脱氧核苷三磷酸（ddNTP）；ddNTP可以与dNTP竞争核苷酸链延长位点，并终止DNA片段的延伸。在4支试管中DNA链将会分别在A、G、C及T位置中止，并形成不同长度的DNA片段，这些片段随后可被电泳分开并显示出来。下列说法正确的是（　　）

A．若采用PCR技术对该待测基因进行扩增，则第n代复制共需要引物2n-1个

B．电泳图谱中的箭头所指的DNA片段以鸟嘌呤结尾

C．ddNTP与dNTP竞争的延长位点是核苷酸链的5'末端

D．测得未知DNA的序列为5'-AGTCGAGCTTAG-3'

6 . 血管为肿瘤的增殖和转移提供了有利条件。E蛋白是人体内抑制血管生长的因子，可作为肿瘤治疗的潜在药物。某科研小组欲用图1所示的质粒构建E蛋白基因表达载体，让其在大肠杆菌中表达出E蛋白，图1中质粒上的。Amp^R为氨苄青霉素抗性基因，Tet^R为四环素抗性基因。回答下列问题：

(1)E蛋白基因上缺少限制酶的识别序列，构建基因表达载体时，为防止目的基因与质粒的自身环化并保证连接的方向性，需要在两种引物的_____端分别添加_____限制酶的识别序列，然后利用该对引物进行PCR 扩增E蛋白基因，使得E蛋白基因两端成功加上限制酶的识别序列。引物的作用是_____。
(2)在基因工程操作中，大肠杆菌是运用最广泛的工程菌，原因是_____（答出2点）。将重组质粒导入大肠杆菌前，先用Ca²⁺处理大肠杆菌，目的是_____。
(3)图1中质粒上的。Amp^R和Tet^R一般充当基因表达载体上的标记基因，其作用是_____。利用质粒上的标记基因，结合微生物的培养，可以淘汰不符合要求的大肠杆菌而获得成功转入重组质粒的大肠杆菌，则应将重组质粒导入_____（填“不抗氨苄青霉素抗四环素”“不抗四环素抗氨苄青霉素”或“不抗氨苄青霉素和四环素”）的受体大肠杆菌中。

7 . CRISPR/Cas9基因编辑技术根据靶基因序列设计向导sgRNA，精确引导核酸酶Cas9切割与sgRNA配对的DNA，相关酶在修复断裂DNA的过程中会改变连接部位的碱基序列。科研人员通过删除编码PD-1蛋白基因的2、3、4片段造成蛋白质的功能缺失，制作PD-1基因敲除鼠的流程如图1所示。将体外转录获得的Cas9mRNA和sgRNA导入小鼠的受精卵中，获得了12只基因编辑小鼠。利用PCR鉴定小鼠的基因型，电泳结果如图2所示。已知P1和P2是PCR的引物，下列相关分析正确的是（       ）

      

A．核酸酶 Cas9敲除2、3、4片段作用在磷酸二酯键，引起的变异属于基因重组

B．欲将基因的2、3、4共3个片段切除，敲除前需要设计3个向导sgRNA

C．图2中，4和12个体杂交的子代均为基因敲除纯合子（不考虑性别）

D．图2中，3、5、9个体的体内均能检测到PD-1基因，8和10个体则不能检测到该基因

8 . 科学家从某细菌中提取抗盐基因，下图是转入烟草细胞并培育成转基因抗盐烟草的过程。图中含目的基因的DNA和质粒上的箭头表示相关限制酶的酶切位点，请分析回答：

(1)①过程获得的抗盐基因可用PCR技术进行扩增，该技术需要加入_____酶，所需的原料是_____。
(2)用图中的质粒和目的基因构建重组质粒，不能使用限制酶切割，原因是_____。
(3)如果利用PCR扩增目的基因时，需要依据图中已知目的基因碱基序列设计引物的序列，在PCR扩增仪中加入的引物的碱基序列为_____和_____-。
(4)图中③为了将表达载体导入农杆菌中，需要用_____处理农杆菌，④过程中为筛选出导入了重组质粒的农杆菌，应在培养基中加_____。
(5)为确定转基因抗盐烟草是否培育成功，在个体水平上鉴定的具体过程是_____。

9 . 下列有关“DNA粗提取与鉴定”、“PCR扩增”、“琼脂糖凝胶电泳”实验的叙述中，正确的是（       ）

A．DNA的粗提取与鉴定实验中可利用DNA在酒精中溶解度较大的特点来提取DNA

B．将提取到的丝状物与二苯胺溶液充分混匀后，溶液即可变为蓝色

C．将扩增得到的PCR产物与含指示剂的电泳缓冲液混合后再注入加样孔

D．在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小、构象等有关

10 . 人血清白蛋白（HSA）主要由肝细胞产生，在临床上的需求量大，由于其来源有限和有生物污染的风险，重组人血清白蛋白（rHSA），成为其重要的替代品。科研人员将HSA基因转入酵母菌细胞，获得了重组人血清白蛋白。如图为酵母菌基因改造以及工业化发酵生产rHSA的过程示意图，其中I、II、III、IV是四种不同的限制酶，具各自识别的酶切位点如表所示。

限制酶	Ⅰ	Ⅱ	Ⅲ	Ⅳ
识别序列及切割位点

(1)若要将HSA基因正确插入质粒中，最好选择限制酶____进行共同切割，重组基因表达载体中的启动子的作用是____。
(2)为筛选出含重组质粒的菌落，采用含有不同抗生素的平板进行筛选，得到甲、乙、丙三类菌落，三类菌落形态相同，生长情况如下图所示，则成功导入目的基因的重组质粒的菌落类型是____类，未导入质粒的菌落类型是____类；（填字母类型）

(3)科研人员提取人肝细胞中的mRNA，并通过反转录法构建了HSA基因，该基因其中一条链的序列为（5'-CCGATCGTTGGAGA…GAATTTCGACCTAG-3'），若通过PCR进行扩增，已知其中一种引物I是5'-CTAGGTCGAAATTC-3'，则另一种引物的序列为____（答出6个碱基序列即可）。
(4)PCR扩增结束后需要对PCR产物进行检测，常采用电泳的方法。电泳一段时间后进行检测，若电泳带有____条，且与DNAMarker对比，产物大小正确，表明PCR扩增成功。
(5)有人提议将乳腺反应器改成膀胱反应器，请分析利用膀胱反应器比乳腺反应器产量高的原因____（答出两点即可）。