1 . 瘦素是一种由脂肪组织合成和分泌的肽类激素。P载体含有的绿色荧光蛋白（GFP）基因能在真核细胞中表达GFP。将目的基因插入GFP基因后，能表达出目的蛋白和GFP的融合蛋白，根据荧光的强弱，可确定目的基因在细胞内的表达情况。为研究瘦素的功能，科学家构建了瘦素基因真核表达载体，检测疫素基因在小鼠成纤维细胞中的表达情况。瘦素基因及载体的结构如图所示。回答下列问题．

(1)PCR扩增瘦素基因时，与引物1互补的a链左侧是脱氧核苷酸链的_______（填“5”或“3”）端。据图推测，构建该基因表达载体时，载体上应有启动子、终止子、标记基因、复制原点、_______，以便与酶切后的瘦素基因正确连接。
(2)已知HindIII和BamHI在载体上的切割位点非常接近。为确定重组质粒是否构建成功，用HindIII、BamHI分别对瘦素基因PCR产物、P载体和重组质粒双酶切，再进行电泳，结果如图所示。若重组质粒构建成功，请在图中将酶切结果对应位置的条带涂黑___________。

(3)Kanr/Neor是一种抗性基因，在真核细胞中表达具有新霉素抗性，而在原核细胞中表达具有卡那霉素抗性。同种基因在真核、原核细胞中表达结果不同，可能的原因是______。本实验中为筛选转化的细胞，应在培养基中添加________________。
(4)为检测瘦素基因是否成功表达，可用的鉴定方法是______（答出2种）。为进一步获得更多能表达融合蛋白的细胞，还需要进行_________。

2 . PCR 技术不仅可用于基础研究，还适用于日常的临床诊断、法医学调查和农业生物技术研究。采用PCR方法进行研究，其反应程序如图所示。下列叙述不正确的是（       ）

   

A．PCR 反应中的每次循环的变性、复性、延伸过程，都涉及氢键的形成或断裂

B．延伸和后延伸过程中需要DNA聚合酶、ATP和4种核糖核苷酸

C．PCR应用于临床病原菌检测，所用的引物应该能与病原菌的两条单链DNA特异性结合

D．后延伸过程可使目的基因的扩增更加充分

3 . 某科研小组欲用图1所示的质粒构建人胰岛素基因表达载体，让其在大肠杆菌中表达出人胰岛素前体物质，对人胰岛素基因所在的DNA片段进行测序，发现其两端附近无限制酶EcoRI、BamHI的酶切位点。已知人胰岛素基因表达时以②链为模板，且其3'端存在启动子，图1所示质粒上的amp^R为氨苄青霉素抗性基因，tel^R为四环素抗性基因。请回答下列问题：

(1)可采用_______来获得人胰岛素基因，这一方法需要先针对人胰岛素基因两端的序列来设计引物对。这一方法获得的产物一般通过______进行鉴定，若鉴定发现其中有许多种相对分子质量比人胰岛素基因小的DNA片段，则原因可能是______（答出一点）。
(2)为保证人胰岛素基因能正确连接到用限制酶EcoRI和BamHI处理的图1所示质粒上，且利用表达载体上的启动子在受体菌中以②链为模板进行转录，则应在配对到①链的引物5'端添加6个碱基，序列为5'-_______-3'。
(3)图1质粒上的amp^R和tet^R一般充当基因表达载体上的标记基因，其作用是______。利用质粒上的标记基因，结合微生物的培养，可以淘汰只转入质粒的大肠杆菌而获得被成功转入人胰岛素基因表达载体的受体菌，则应将重组载体导入经________处理后的________（填“不抗氨苄青霉素”“不抗四环素”或“不抗氨苄青霉素和四环素”）的受体大肠杆菌中。

4 . 目的基因和载体如果用同一种限制酶处理，连接时会出现正反接的情况，为鉴定筛选出的表达载体中是否含有正确插入目的基因的重组质粒，拟设计引物进行PCR后，结合电泳技术鉴定，图示为甲、乙、丙3条引物在正确重组质粒中的相应位置，其中目的基因为长度300bp的片段。下列有关说法错误的是（       ）

   

A．PCR复性温度不宜太低，避免引物错配和模板链形成双链

B．电泳条带迁移的位置和速度与DNA分子的大小、带电量和构象有关

C．选取引物甲、丙，扩增出450bp长度片段时，可以说明目的基因正接

D．选取引物甲、乙，扩增出400bp长度片段时，可以说明目的基因反接

5 . 易错PCR是利用低保真的Taq酶和改变PCR的反应条件，降低DNA复制的准确性，在新DNA链的合成过程中增加碱基错配，从而使扩增产物出现较多点突变的一种体外诱导DNA序列变异的方法。从自然界中的生物体内分离得到的天然酶，在工业生产环境中催化效率往往较低。下图是研究人员利用易错PCR技术对某种天然酶进行改造，获得了高催化效率的酶的流程示意图。回答下列问题：

   

(1)在体外利用PCR技术扩增目的基因时，使反应体系中的模板DNA解链为单链的条件是_____，PCR反应体系中需添加引物，引物的作用是_____
(2)图中步骤①为易错PCR过程，其扩增过程中需要加入Taq酶，这是因为Taq酶具有_____的特点。图中步骤②是将构建的重组质粒溶于缓冲液中与用_____处理的受体菌混合，在一定温度下完成转化。转化是指_____。
(3)Taq酶的某一区域负责将碱基与模板链正确地互补配对，Mn²⁺可以降低这一功能；非互补的碱基对由于氢键不易形成，稳定性差，Mg²⁺可以提高该错配区的稳定性。因此，与普通PCR相比，易错PCR的反应体系中应适当_____（填“提高”或“降低”）Mn²⁺浓度、_____（填“提高”或“降低”）Mg²⁺浓度。

6 . γ-氨基丁酸（GABA）在降低血压、治疗神经损伤、生产可降解材料等方面有广泛应用，高效制备GABA是目前国内外的研究热点。科研人员运用基因工程技术构建重组表达载体（如图所示），将其成功导入大肠杆菌获得能生产GABA的工程菌。该菌利用目的基因表达产物GadB，催化L-谷氨酸脱羧大量合成GABA。请回答下列问题：

(1)在基因工程操作中，大肠杆菌是运用最广泛的工程菌，原因是___。
(2)由图可知，步骤①用于切割质粒的限制酶是___，这种切割方式在实践中的优势是___。
(3)在进行步骤②之前，需对gadB基因进行扩增以提高获得重组质粒的概率。现在常用的快速扩增技术是PCR，扩增过程使用的DNA聚合酶具有的特点是___，扩增过程中使用的引物___（填“可”或“不可”）重复利用。
(4)为筛选出含重组质粒的大肠杆菌，应在添加___的选择培养基上培养；培养后获得的菌落却不能判定是否含有重组质粒，理由是___。进一步检测成功转化的GABA高产大肠杆菌，可通过检测___获得（写出2个检测指标）。

7 . 用限制酶Spe Ⅰ和Hind Ⅲ切割质粒，用限制酶Hind Ⅲ和Xba Ⅰ切割目的基因，之后连接，构建基因表达载体。下列叙述错误的是（       ）

限制酶	Spe I	Hind Ⅲ	Xba I
识别序列

   

A．若该质粒导入微生物中可用感受态转化法

B．构建的基因表达载体除图示组成外，还需有启动子和终止子

C．表中限制酶的种类不能将目的基因剪切并插入质粒中

D．利用PCR技术获取目的基因时，引物的延伸方向是从5’端到3’端

8 . 聚合酶链式反应（PCR）能实现对相应核苷酸序列的大量复制，相关叙述错误是（       ）

A．该技术的原理是DNA的半保留复制

B．复性是为了使解旋后的两条链与引物碱基互补配对

C．该技术参与的组分有耐高温的DNA聚合酶，引物、4种脱氧核苷酸和解旋酶等

D．PCR技术的产物通常用琼脂糖凝胶电泳进行鉴定

9 . 鲸死亡后会沉入海底，俗称“鲸落”。“鲸落”后期会形成一个以厌氧菌和硫细菌等为主体的生态系统。厌氧菌以“鲸落”肌肉中的脂肪为食，同时产生一些硫化氢等硫化物。硫细菌将硫化物氧化成硫酸盐，并以该过程中释放的能量合成有机物。请回答相关问题：
(1)培养微生物的培养基中一般都会含有水、无机盐、氮源和碳源，培养“鲸落”群落中厌氧菌的碳源是______。硫细菌属于______（填“自养或“异养”）生物，因此培养基中的成分需要特殊配制，主要体现在______，这种培养基可以用来专一性培养硫细菌，所以属于______培养基。
(2)科学家欲研究死鲸的遗传属性，在“鲸落”中提取到了死鲸的DNA,然后可以用PCR技术对其DNA进行扩增，在扩增死鲸DNA的过程中，除了要加入死鲸的DNA作模板外，还需要加入______（至少答三种）等物质。
(3)为了统计“鲸落”中含有微生物的数量，需将“鲸落”提取物加水稀释，然后将稀释水样用涂布器分别涂布到培养基进行培养后计数，这种方法称为______。下面所示的四种菌落分布情况中，不可能由该方法得到的是______。与实际活菌数相比，该方法的统计结果一般偏小，原因是______。

10 . 东北酸菜是白菜经腌制而成的传统食品。发酵过程中常因霉菌等大量繁殖导致酸菜腐败发臭。黑龙江大学科研人员从酸菜中分离出具有高效抗菌活性的乳酸菌用于发酵，将白菜腌制成了口感好、保质期长的“黑大酸菜”。回答下列问题：
(1)为获得具有高效抗菌活性的乳酸菌菌种，需要从市售保质期______（填“较长”或“较短”）的酸菜中进行筛选。
(2)通常可利用______法对培养基进行灭菌分离根瘤菌进行培养，可以获得纯培养物，此实验中的纯培养物是______。
(3)筛选出的乳酸菌能分泌一种新型的细菌素（多肽），因而具高效抑菌活性。研究人员从该种乳酸菌中提取细菌素基因，利用基因工程技术获得了高效表达细菌素的工程菌。
①利用PCR技术扩增细菌素基因时，经过4轮循环，消耗引物的个数是______。
②一般用______的方法对扩增产物进行检测，结果如下图：

注：电泳图谱中1号为DNA标准样
2号PCR的模板是“未转化”的受体菌DNA
3号PCR的模板是“已转化”的受体菌DNA
4号对应的PCR体系未加模板DNA
设置4号的目的是______（答出1点即可），电泳结果表明______。
③进一步通过检测与鉴定最终获得了高效表达细菌素的工程菌。