25. 哺乳动物体内一定含量的w-3多不饱和脂肪酸(LCPUFA)可以起到预防心血管疾病的作用,但LCPUFA在大多数动物体内不能合成,只能从食物中摄取。科研人员从秀丽隐杆线虫中获得LCPUFA合成酶基因fat-1(1229bp),培育转fat-1基因家兔,其部分流程如图一所示。
(1)PCR扩增fat-1基因的前提是
______,以用于特异性制备PCR扩增需要的引物。PCR扩增过程中,经过4轮循环后,得到的产物中只含一种引物的DNA分子占比为
_______。
(2)在构建PEBf质粒时,为确保fat-1基因按正确方向插入,需要双酶切,还需对fat-1基因的引物进行相应设计。已知fat-1基因转录的模板链为a链,与b链结合的引物5'端添加了限制酶识别序列GAATTC,则另一引物5’端需添加的限制酶识别序列为
______,理由是
_______。
(3)转染是将外源分子如DNA、RNA等导入真核细胞的技术。为了检验图一家兔成纤维细胞是否转染成功,科研人员分别提取培养液中各细胞的DNA,利用fat-1基因引物进行PCR扩增后电泳,部分结果如图二所示。据图分析,1组和2组分别是
____细胞组PCR产物。
(4)检测转基因家兔细胞中是否含有LCPUFA合成酶,可采用
______技术。如果fat-1基因已正确插入PEB质粒且成功转染,但在转基因家兔细胞中没有检测到LCPUFA合成酶,从构建基因表达载体的角度分析,可能的原因是
_______。