22. 热激蛋白是一种普遍具有抗逆作用的保护蛋白,在植物处于逆境下发挥其重要的调控作用。HSP70是植物中含量最多的热激蛋白,研究已经证明南瓜细胞中HSP70基因的表达与植物获得的耐热性呈显著正相关性。花楸树为蔷薇科落叶小乔木,具有很高的园林观赏价值,但花楸树引种到低海拔地区后面临着严峻的夏季高温环境胁迫,其正常生长及观赏价值会被影响。欲将南瓜细胞中的HSP70基因(结构如图1所示,其中B链是转录的模板链)用图2所示的质粒导入花楸树细胞来研究其表达与耐热性之间的关系。回答下列问题:
注:XhoI、KpnI、SacI为三种限制酶,其识别位点分别是5'CTCGA↓G、5'G↓GTACC、5'GAGCT↓C;Amp
R基因为氨苄青霉素抗性基因。
(1)可通过提取南瓜细胞中的
______经逆转录获得HSP70基因,并用PCR对其进行扩增。在PCR扩增HSP70基因时应选择的引物组合是引物
______。为使扩增后的产物按照正确方向与质粒连接,需在引物
______(填“I”“Ⅱ”“Ⅲ”或“IV”)的5'端添加-CTCGAG序列。
(2)通过农杆菌转化法转化花楸树细胞后,可以使用含
______的选择培养基筛选出含有目的基因的花楸树细胞。将某细胞培育为植株后进行自交,收获子代植株641株,其中不耐高温的植株为42株,不考虑突变和互换,出现该结果的原因最可能是
______。
(3)为了检测目的基因是否成功导入并是否稳定维持和表达其遗传特性,可从分子水平上用PCR技术进行检测。若用PCR技术进行检测,以花楸树细胞提取的DNA为模板,PCR扩增HSP70基因片段后进行琼脂糖凝胶电泳实验,结果如图3(1号为空白对照,2、3号为转基因植株)所示。若与1号相比,2号花楸树植株的耐热能力没有增强,原因可能是
_______。